Regulation of cardiac gene expression by transcriptional and epigenetic mechanisms and identification of a novel chromatin remodeling factor

Abstract

For the development and maintenance of all eukaryotic organisms, the process of gene transcription needs to be regulated by a set of different cellular levels comprising transcriptional, epigenetic and post-transcriptional mechanisms. Taking the mammalian heart as model, we present a systems biology approach investigating the regulation of mRNA profiles by the interplay between tissue-specific transcription factors (TF), co-occurring histone modifications and miRNAs. The analysis of ChIP-chip and RNAi mediated knockdown experiments for the four key cardiac TFs Gata4, Mef2a, Nkx2.5 and Srf revealed a high number of common regulated genes as well as binding sites. Strikingly, we found a high number of genes bound by multiple TFs that were significantly less likely differentially expressed in the respective knockdown, indicating a complex and cooperative regulation of gene expression whereby these four non-paralogous can potentially compensate each other’s function. Co-occurring histone 3 acetylation (H3ac) were found to have a high impact on the expression of Srf and Gata4 target genes. The correlation between Srf and H3ac was further investigated using ChIP-seq and ChIP-qPCR after Srf knockdown. Our results provide evidence that Srf triggers the acetylation at particular target genes and moreover, that H3ac buffers the activating function of Srf in its knockdown. In addition, we identified a panel of miRNAs deregulated in Srf knockdown that can explain three times more differentially expressed genes than Srf binding events alone can do. To get a better understanding of the Srf-driven regulation of transcription we investigated the binding of Srf and the histone acetyltransferase p300 and the co-occurrence of H3ac and histone 3 lysine 4 di-methylation. We selected regulatory regions important for heart and muscle development and screened their binding behaviour in a time-series of mouse hearts of three developmental stages around birth using ChIP-qPCR. We observed a strong correlation between all four factors pointing to a common regulatory mechanism, which is triggered by Srf and has H3ac as outcome that is to a certain degree independent from p300. In addition, the correlation of expression levels of target genes with the dynamic changes of the studied factors indicated a high variability of combinatorial regulation. For our comprehensive ChIP experiments in mouse hearts, we applied the novel LightCycler® 1536 real-time PCR System, which we evaluated beforehand for its applicability in context of a beta-side testing of the Roche Company. We found that the new system is a very applicable qPCR system that offers the analysis of 1536 reactions per run within a short time period and with low consumption of reagents and sample material, providing a very suitable PCR system for medium and high-throughput analyses. Finally, the functional role of DPF3 was characterized in more detail as it emerged as likely cardiac relevant due to its up-regulation in patients with congenital heart disease. We identified DPF3 as novel chromatin remodeling factor important for heart and muscle development. Tandem Affinity Purification followed by MassSpec Analysis revealed DPF3 as a component of the human BAF chromatin remodeling complex. In addition, the isoform DPF3b contains the first double PHD finger that binds methylated lysine residues of histone 4 as well as acetylated lysine residues of histones. To summarize, this work revealed a fine-tuned regulation of cardiac gene expression directed by the combinatorial influence of key cardiac TFs, while histone modifications and miRNAs modulate their functional consequence with a high degree of interdependency. We gained more insights into the functional role of DPF3, which might serve as tissue-specific anchor that recruits the BAF complex to heart and muscle relevant genes via its interaction with modified histones.

Für die Entwicklung und Aufrechterhaltung aller eukaryotischen Organismen muss die zeitliche und zellspezifische Expression von Genen durch einen umfassenden Satz von verschiedenen zellulären Mechanismen reguliert werden. Zum besseren Verständnis der molekularen Grundlagen der Transkription, untersuchten wir das Zusammenspiel von drei Ebenen, die an der Regulation von kardialen Transkriptionsnetzwerken beteiligt sind. Diese beinhalteten die Bindung herzspezifischer Transkriptionsfaktoren (TF) an Zielgene, das gleichzeitige Auftreten von Histonmodifikationen, sowie den Einfluss von miRNAs auf post- transkriptioneller Ebene. Die Durchführung und Analyse von umfangreichen ChIP- chip und RNAi-vermittelten Knockdown Experimenten mit den für die Herzentwicklung wichtigen TF Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf ergab eine hohe Anzahl von gemeinsam regulierten Genen sowie Bindestellen. Interessanterweise waren Zielgene, die von mehreren TF gebunden wurden, am seltensten im jeweiligen Knockdown dereguliert. Dies lässt auf eine komplexe und kooperative Regulation der Genexpression schließen und deutet auf einen potentiellen Puffereffekt durch kombinatorische Bindung hin, wobei die Genexpression auch beim Ausfall eines einzelnen TF weiter aufrechterhalten werden kann. Eine gleichzeitige Acetylierung von Histon 3 (H3ac) zeigte einen signifikanten Einfluss auf die Expression von Gata4- und Srf Zielgenen. Weitere ChIP-seq und ChIP-qPCR Experimente nach gezieltem Srf Knockdown bestätigten den Zusammenhang zwischen Srf und H3ac. Zudem deuteten unsere Daten sowohl einen Puffereffekt der H3ac auf die Expression von Srf-Zielgenen in dessen Knockdown, als auch eine Srf-gesteuerte Acetylierung an ausgewählten Zielgenen an. Unsere Untersuchung hinsichtlich des Einflusses von miRNAs ergab, dass bis zu 45% aller differentiell exprimierten Gene durch den Einfluß von miRNAs erklärt werden können, wodurch diese vielversprechende Kandidaten für die Regulation von indirekten Zielgenen sind. Mittels ChIP-qPCR von Mäuseherzproben verschiedener Entwicklungsstadien kurz vor und nach der Geburt, analysierten wir den Zusammenhang zwischen der Srf-getriebenen Transkriptionsregulation in Korrelation mit der Histon-Acetyltransferase p300 und dem gleichzeitigen Auftreten von H3ac und Histon-3 Lysin-4-Dimethylierung an ausgewählten herz- und muskelspezifischen Zielgenen. Wir beobachteten eine deutliche zeitliche Korrelation zwischen allen vier Faktoren, was auf einen gemeinsamem Mechanismus hindeutet, der von Srf ausgelöst wird und eine H3ac zur Folge hat, die zu einem gewissen Grad p300-unabhängig zu seien scheint. Darüber hinaus zeigte die Korrelation zwischen Expression von Zielgenen und dynamischer Bindung eine hohe Variabilität durch kombinatorische Regulierung. Für unsere umfangreichen ChIP Experimente mit Mäuseherzproben verwendeten wir das neue LightCycler® 1536 Real-Time PCR System, welches wir zuvor auf seine Anwendbarkeit im Rahmen einer Evaluierung geleitet durch die Firma Roche, getestet haben. Das neue System ermöglichte die Analyse von 1536 Reaktionen pro Lauf innerhalb eines kurzen Zeitraums mit geringem Proben- und Materialverbrauch, und ist damit ein gut geeignetes PCR-System für Mittel- und Hochdurchsatzanalysen. Der für die Herz- und Muskelentwicklung wichtige epigenetische TF DPF3, welcher in Patienten mit angeborenen Herzfehlen stark hochreguliert ist, konnte mittels Affinitätsaufreinigung als Komponente des humanen BAF Chromatin-Remodeling-Komplexes identifiziert werden. Die Isoform DPF3b enthält den ersten bekannten Doppel-PHD Finger, der sowohl methylierte als auch acetylierte Histone erkennt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass unsere durchgeführten Analysen zu Regulationsmechanismen von kardialen Transkriptionsnetzwerken ein hohes Maß an Komplexität und Flexibilität ergaben, wobei die verschiedenen genetischen, epigentischen und post- transkriptionellen Regulationsebenen vielfach miteinander verknüpft sind und wechselwirken. Des Weiteren identifizierten wir DPF3 als gewebespezifische Untereinheit des BAF Komplexes, der durch gezielte Interaktion mit Histonmodifikationen diesen eventuell zu herz- und muskelspezifischen Genen rekrutieren kann.