Nuclear receptor pathways in Caenorhabditis elegans:DIN-1, a DAF-12 coregulator of dauer diapause and developmental arrest

Abstract

The lifecycle of the nematode Caenorhabditis elegans depends on environmental conditions. Under favorable conditions, worms develop from egg to adult in three days, passing 4 larval stages (L1-L4). In unfavorable conditions, they arrest development at larval stage 1 or 3 and enter diapause. The dauer larva, is stress resistant, long- lived and specialized for survival and dispersal. The nuclear hormone receptor DAF-12 regulates L3 developmental decision between reproductive growth diapause. DAF-12 integrates signals from several endocrine pathways including serotonergic, insulin/IGF, TGF-ß and cGMP signaling (the dauer pathways) via a postulated DAF-12 regulating hormone. In addition, DAF-12 has a role in specifying developmental stage programs in the heterochronic pathway, and in concert with genes from insulin/IGF signaling, it influences the life span of C. elegans. In order to identify components of postulated DAF-12 regulator complexes, we screened for DAF-12 interacting factors using the yeast-two hybrid method. We identified 22 candidates, seven of which were selected for further studies. For functional characterization of the putative DAF-12 interactors, we performed RNAi feeding assays. One of the candidates, F07A11.6 = din-1 suppressed dauer constitutive (Daf-c) phenotypes of reduced insulin receptor (daf-2), TGF-ß (daf-7), guanyl cyclase (daf-11), cytochrome P450 (daf-9) and nuclear receptor daf-12 signalling. Moreover, din- 1RNAi suppressed daf-9 and daf-12 heterochronic gonadal migration phenotypes (Mig), as well as daf-12 heterochronic phenotypes in the epidermis. These results place DIN-1 downstream or parallel to the dauer pathways, as well as downstream or parallel to nuclear hormone receptor signal transduction. Protein. BLAST alignments revealed DIN-1 homologous, the nuclear repressor proteins SHARP and MINT in mammals, the Split ends protein SPEN in D. melanogaster,and the C. elegans protein F29C4.7. Gene finder analyses predict that the largest din-1 product consists of 2784 aa which is organized in 21 exons. In contrast to gene finder prediction, analyses of din-1 EST- cDNA clones and cDNA clones obtained by RT- PCR revealed that most of the din-1 clones lacked exon 18 and harbored an additional exon 3. We found several lines of evidence for the presence of a short din-1 isoform, comprised of exons 18-22 (568 aa), suggesting that din-1 isoforms originate from two transcriptional units. EMS-mutagenesis screens for revertants of the gonadal Mig phenotype of daf-12 ligand binding domain mutants revealed five din-1 alleles. Representative alleles suppressed dauer pathway mutant Daf-c and heterochronic phenotypes, thus confirming our findings for din-1 RNAi. din-1 mutants cluster in the exon 18, which corresponds to the DIN-1-DAF-12 interaction domain, suggesting that the DIN-1-DAF-12 association is disrupted, but also indicating that none of them is a null allele. Aging experiments indicated that in daf-2(e1370); din-1(dh127) double mutants mean life span is increased by 35% compared to already long- lived daf-2(e1370) alone. din-1 mutants alone lived as long as wild type. Expression studies with green fluorescence protein (gfp) tagged DIN-1 constructs uncovered wide spread expression in nuclei of different cell types throughout development. The nuclear localization of din-1 is consistent with a function in transcriptional regulation. We suggest that in unfavorable conditions where the production of a dauer diapause suppressing hormone is blocked, DIN-1 binds to DAF-12, assembling a corepressor complex that subsequently arrests reproductive development and promotes dauer diapause. In concordance with the homologues SHARP and MINT in mammals, SPEN in Drosophila and F29C4.7 in C. elegans, DIN-1 forms a class of large nuclear proteins involved in the coordination of basic developmental pathways.

Der Lebenszyklus des Fadenwurms Caenorhabditis elegans ist Umweltabhängig. Unter günstigen Bedingungen entwickelt sich der Wurm innerhalb von drei Tagen vom Ei zum erwachsenen Tier, wobei er vier Larvalstadien (L1-L4) durchläuft. Unter ungünstigen Umweltbedingungen stoppt die Entwicklung im ersten oder im dritten Larvalstadium und geht in die Dauer-Diapause über. L3 Dauerlarven sind langlebig und resistent gegen oxidativen Stress. Die ontogenetische Alternative zwischen der Ausbildung der Dauerlarve und reproduktivem Wachstum wird vom Nuklearhormonrezeptor DAF-12 gesteuert. DAF-12 integriert Signale aus Serotonin-, Insulin / IGF-, TGF-ß- und cGMP-Signaltransduktionswegen (den Dauer-Signalwegen) über ein postuliertes DAF-12-regulierendes Hormon. Zusätzlich fungiert DAF-12 im heterochronen Signaltransduktions-weg als spezifizierende Komponente von Entwicklungsstadien. Gemeinsam mit Genen aus dem Insulin/IGF- Signalweg beeinflußt DAF-12 auch die Lebensspanne von C. elegans. Mittels der Yeast-Two Hybrid Methode wurden 22 mögliche DAF-12 Interagierer identifiziert. Eine erste Charakterisierung der Kandidaten erfolgte durch RNAi-Experimente. Einer von ihnen, din-1 (F07A11.6),unterdrückte dauer-konstitutive (Daf-c) Phänotypen von Insulinrezeptormutanten, (daf-2), TGF-ß-(daf-7), zyklischem GMP-(daf-11) und Cytochrom P450-(daf-9) Mutanten. Außerdem unterdrückte din-1RNAi auch Phänotypen von daf-9- und daf-12- Mutanten mit gestörter Migration der Gonaden (Mig-Phänotyp) sowie daf-12-Mutanten mit gestörten zeitlichen Abläufen in der Epidermisentwicklung (heterochroner Phänotyp). Aufgrund dieser Ergebnisse erfolgt die Einordnung von DIN-1 stromabwärts oder parallel zu den Dauer- Signaltransduktionswegen. Protein BLAST-Analysen zufolge zeigt DIN-1 die größte Übereinstimmung mit den nuk-learen Repressorproteinen SHARP (H. sapiens), MINT (M. musculus), dem split ends-Protein SPEN (D. melanogaster) und mit dem C. elegans- Protein F29C4.7. Das Programm "Gene Finder" sagt ein aus 2784 Aminosäuren bestehendes din-1 Genprodukt voraus, das in 21 Exons organisiert ist. Im Gegensatz dazu ergaben unsere Analysen, dass den untersuchten din-1 cDNA Klonen das Exon 18 fehlte. Außerdem enthielten sie ein zusätzliches Exon 3. Wir fanden mehrere Anhaltspunkte für das Vorhandensein einer kurzen din-1 Isoform, bestehend aus den Exons 18-22 (568 Aminosäuren) und dafür, dass DIN-1 von mindestens zwei transkriptionellen Einheiten gebildet wird. EMS-Mutagenese Screens für Revertanten des Mig-Phänotyps von daf-12-Mutanten mit verkürzter Ligandenbindedomäne ergaben 5 din-1 Allele. Heterochrone oder Daf-c Phäno-typen von Mutanten mit Defekten in einem der Dauer-Signalwegsgene wurden von einer zusätzliche din-1 Mutation aufgehoben und die Tiere entwickelten sich phänotypisch normal. Alle fünf din-1 Mutanten kartierten im Exon 18, das gleichzeitig die DAF-12- DIN-1 Interaktionsdomäne bildet. Dies bedeutet einerseits, dass in din-1 Muanten die Assoziation von DAF-12 und DIN-1 aufgehoben ist, und andererseits, dass wahrscheinlich keines der din-1 Allele ein Nullallel ist. Alterungsexperimente ergaben, dass daf-2 (e1370); din-1(dh127)-Doppelmutanten im Schnitt 35% länger leben als die bereits langlebige daf-2(e1370)-Mutante. Dagegen zeigten din-1- Mutanten alleine keine überdurchschnittliche Lebensdauer. Um die din-1 Expression im lebenden Tier zu untersuchen, wurden din-1 Konstrukte injiziert, die mit grünem Fluroessenzprotein (gfp) markiert waren. din-1 wird während der gesamten Entwicklung im Zellkern exprimiert, Die Tatsache, daß DIN-1 im ganzen Tier nuklear expremiert wird, spricht für eine Funktion von din-1 in der transkriptionellen Regulation. Wir vermuten, dass die Produktion eines Dauer Diapause unterdrückenden Hormons unter ungünstigen Umweltbedingungen unterbrochen ist. Wir schlagen vor, dass infolgedessen DIN-1 an DAF-12 bindet, worauf ein Co- Repressorkomplex rekrutiert wird, der die reproduktive Entwicklung stoppt und die Dauer Diapause auslöst. Zusammen mit den Säugerhomologen SHARP und MINT, SPEN aus D. melanogaster und dem C. elegans- Protein F29C4.7 bildet DIN-1 eine Klasse nuklearer Proteine, die grundlegende Signaltransduktionswege während der Ontogenese koordinieren.