Das eisenhaltige Cytosin-Analogon Ferropoptosid (N69) induziert Caspase- unabhängige aber ROS-abhängige Apoptose in Melanom-Zellen

Abstract

Das Maligne Melanom zeichnet sich durch hohe Aggressivität auf Grund starker Resistenz gegenüber gängigen Chemotherapeutika aus. Die schwachen Ansprechraten lassen sich auf die massive Apoptose-Defizienz von Melanomzellen zurückführen. Der genetisch festgelegte Prozess der Apoptose (programmierter Zelltod) beschreibt einen Schutzmechanismus multizellulärer Organismen zur Eliminierung überflüssiger oder entarteter Zellen. Die Entwicklung und Charakterisierung neuer Chemotherapeutika zur Überwindung der Resistenzen ist dringend notwendig. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Strategie zur Induktion der Apoptose in Melanomzellen überprüft. Das eisenhaltige Cytosin- Analogon Ferropoptosid (N69) löste signifikant in niedrigen Konzentrationen und nach kurzer Zeit Apoptose in Melanomzellen aus. Dabei konnten typische Charakteristika wie DNA-Fragmentierung, Chromatin-Kondensation und Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials festgestellt werden. Dennoch war die durch N69 induzierte Apoptose in Melanomzellen primär völlig unabhängig von einer Caspasen-Aktivierung. Es konnten weder gespaltene Caspasen detektiert werden, noch konnten selektive Caspase-Inhibitoren den pro-apoptotischen Effekt von N69 verhindern. Cathepsine wurden zu späten Zeitpunkten aus den permeabilisierten Lysosomen freigesetzt. Daher sind sie wohl eher nicht ursächlich für die frühe Apoptose, was durch die Wirkungslosigkeit von selektiven Cathepsin-Inhibitoren belegt wurde. Cytochrom C und der Apoptose- induzierende Faktor (AIF), der seine proapoptotische Wirkung Caspasen- unabhängig entfaltet, wurden aus den Mitochondrien freigesetzt, was zusätzlich durch die Abnahme des Mitochondrien-Membranpotentials bestätigt wurde. Zusätzlich wurde eine Hochregulation von Bak festgestellt, was zu Porenbildungen in den Mitochondrien- Membranen beitragen kann. Ein wichtiges Charakteristikum von organischen Eisenverbindungen ist die Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Als ein Hinweis auf neue proapoptotische Signalwege in Melanomzellen durch N69 wurde ein erhöhter ROS-Spiegel festgestellt. Durch Vitamin E konnte der ROS-Spiegel auf Kontroll-Niveau gesenkt und dadurch die Apoptose inhibiert werden. ROS können Lipide, Proteine und DNA schädigen und so zur Apoptose führen. Die hier identifizierte besondere Rolle von ROS in der Apoptoseregulation von Melanomzellen könnte in der Behandlung des Malignen Melanoms genutzt werden, um die Apoptoseresistenz zu überwinden und die Wirksamkeit bestehender Therapieformen zu optimieren.

Malignant melanoma is characterized by a high malignancy due to its strong resistance against common chemotherapeutics. The weak respondence is related to massive apoptosis deficiency in melanoma cells. The genetically regulated process of apoptosis (programmed cell death) describes a protection mechanism of multicellular organisms in order to eliminate useless or degenerated cells. Development and characterization of new chemotherapeutics are urgently required. In the present study a new strategy for induction of apoptosis in melanoma cells was investigated. The iron-containing cytosine analogue ferropoptoside (N69) significantly induced apoptosis in melanoma cells in low concentrations and after early times. Typical characteristics of apoptosis as DNA fragmentation, chromatin condensation and decrease of mitochondrial membrane potential were seen. However apoptosis induced by N69 in melanoma cells was primary completely independent of caspase activation. Neither cleaved caspases were detected, nor could selective caspase inhibitors prevent the proapoptotic effect of N69. Cathepsins were released from permeabilized lysosomes at late times. Thus they are probably not causal for early apoptosis, which was proven by the inefficiency of selective cathepsin inhibitors. Cytochrome C and apoptosis inducing factor (AIF), which develops the proapoptotic activity caspaseindependent, were released from mitochondria, which was additionally proven by a decrease of the mitochondrial membrane potential. Additionally an upregulation of Bak was seen, which can lead to pore buildings in the mitochondrial membranes. An important hallmark of organic iron compounds is the formation of reactive oxygen species (ROS). As an indicator for new proapoptotic pathways in melanoma cells by N69 an increased ROS level was found. By the use of Vitamine E ROS level could be reduced nearly to control level and apoptosis was thereby blocked. ROS are able to oxidize lipids, proteins and DNA and thus lead to apoptosis. This identified specific role of ROS in apoptosis regulation of melanoma cells could be used for treatment of malignant melanoma to overcome the apoptosis resistance and to optimize the efficiency of current therapies.