dc.contributor.author
Holzhausen, Cornelia
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:56:21Z
dc.date.available
2017-09-26T13:24:01.060Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5593
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9792
dc.description.abstract
The prefix “nano” refers to any material smaller than 100 nm in one dimension.
Materials with all dimensions in the nanoscale are defined as nanoparticles
(NPs). At this dimension quantum effects unfold and nanomaterials (NMs) show
an enhanced reactivity due to their high area-to-mass ratio. Many
opportunities for innovations in industry and biomedicine originate from the
unique features of NMs. In biomedicine their applications include medical
devices, in vitro and in vivo diagnostics, drug delivery and therapeutics. A
promising NP for different biomedical applications, in which the most
prominent are the diagnosis and therapy of inflammation, is the dendritic
polyglycerol sulfate (dPGS). However, the unique features of NMs can also lead
to unforeseeable behaviour and may bear safety risks. Problems in risk
management of NMs are in particular the missing consensus and availability of
methods adequate for safety testing. Furthermore, to date specific regulatory
guidance has been released for only a few NMs. The vast majority of NMs are
regulated in preclinical approval like “regular” small drugs in accordance
with the guidance document M3(R2) of the International Council for
Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use.
With reference to M3(R2), preclinical drug approval includes pharmacology,
toxicokinetics and pharmacokinetics as well as toxicity studies. Yet further
parameters, related to the unique features of NMs, such as particle size or
aggregation effects, may be needed for risk assessment. Moreover, standard
tests can interfere with NMs and require verification. The study presented
here surveys the kinetics as well as the acute and subacute toxicopathology of
dPGS and thus contributes to providing a basis for further research with a
view towards drug approval. In previous in vivo efficacy studies fluorescently
labelled dPGS showed no obvious acute adverse effects. The assessment of dPGS
for biomedical applicability has so far been promising, but no systematically
surveyed data regarding the distribution, elimination and histopathology of
healthy animals, as common determinants in preclinical safety assessment, were
available. Furthermore, fluorescent labelling is thought to alter NP
properties leading to a different biodistribution, and hence requires
verification. In addition, fluorescent labelling does not allow for
histopathological evaluation. Techniques feasible to trace “soft” NPs such as
dPGS in vivo are, however, limited. Due to their small size, all NPs escape
the wavelength of light and require labelling for light microscopy, while the
low atomic number of “soft” NPs also rules out electron microscopy. There are
innovative methods, such as Raman microspectroscopy, which do not require
labelling and allow NPs to be localised in cells and enable cellular
alterations to be evaluated, but have the disadvantage of being technically
demanding and not widely available. An alternative to labelling with
fluorophores is labelling with radioisotopes. Provided the isotope is well
integrated, the chemical structure of the NP is preserved. The radiation can
be recorded by whole body/organ autoradiography (WBA/WOA), but can also be
used for quantitative kinetic studies employing quantitative whole body/organ
autoradioluminography (QWBA/QWOA) or liquid scintillation counting (LSC). Yet,
these techniques only provide data on tissue level. To detect radioactively
labelled NPs in cells, the light microscopic autoradiography (LMA) was
established in this study. LMA also allows for concurrent histopathological
analysis. The radioisotope 35S was incorporated into the dPGS NP specifically
for this study. This isotope was particularly suitable because sulfur is a
constituent of dPGS. It should be noted that amino functions were integrated
for easy conjugation with a drug or dye. The resulting radioactive dPG35S
amine was administered i.v. or s.c. to healthy mice. The mice were sacrificed
but not exsanguinated at different time points following application, and
samples were collected for LSC or autoradiography (WOA, QWOA, and LMA). The
dPG35S amine concentration in liver and spleen increased up to 5 and 21 days
following i.v. application respectively. Evaluation of tissue sections with
LMA localised dPG35S amine in the Kupffer cells of the liver and in the red
pulp of the spleen 24 hours, 5 and 21 days post dose. In other organs such as
the kidney, lung, intestine, testes, and brain the overall dPG35S amine
concentration decreased over time. Only low concentrations were measured in
the testes and marginal concentrations in the brain, suggesting a tight blood-
tissue barrier for this NP. Furthermore, dPG35S amine was found in the faeces
and at early time points in the urine. Taken together these data do indeed
suggest a partial elimination via the liver and kidney, but apart from that
dPG35S amine is retained in the Mononuclear Phagocyte System (MPS). Particles
that are not readily degraded in macrophages become sequestered, as confirmed
by LMA for dPG35S amine. The long apparent terminal blood half-life of dPG35S
amine, exceeding 12 days, also indicates retention. Apart from the delayed
onset, the distribution of this NP to the organs after s.c. application was
very similar to its i.v. application. In this study neither the clinical
evaluation during the experiment nor the gross and histopathological analysis
of the examined tissue showed any adverse effects. Thus, from a
pathomorphological point of view, there was no evidence that would impede
future investigations of dPGS for biomedical usage. Accumulation of dPGS in
MPS cells, which is known for other charged NPs as well and depends on the
protein corona of the NP, however, always bears the risk of toxicity and
hinders an application as a therapeutic or diagnostic agent. In addition,
retained NPs may interfere with diagnostic imaging. The retention of dPGS in
MPS cells will have to be addressed using long-term and repeated-dose toxicity
testing as well as in any further attempts to develop dPGS for biomedical
applications.
de
dc.description.abstract
Die Vorsilbe „Nano“ bezeichnet alle Materialen kleiner als 100 nm in einer
Dimension. Materialien mit allen Abmessungen im nanoskalaren Bereich werden
als Nanopartikel (NPs) bezeichnet. In dieser Größenordnung treten
Quanteneffekte zum Vorschein. Zudem zeigen Nanomaterialien (NMs) als Folge
ihres hohen Fläche-zu-Masse-Verhältnisses eine erhöhte Reaktivität. Aus den
besonderen Eigenschaften von NMs ergeben sich viele Chancen für Innovationen
in Industrie und Biomedizin. In der Biomedizin umfasst ihr Einsatzbereich
Medizinprodukte, in vitro und in vivo Diagnostik, Arzneimittelträger und
Therapeutika. Ein vielversprechender NP für verschiedenste biomedizinische
Anwendungen, von denen die größte Bedeutung in der Diagnose und Therapie von
Entzündungen liegt, ist das dendritische Polyglycerol Sulfat (dPGS). Die
besonderen Eigenschaften von NMs können jedoch auch zu unvorhersehbarem
Verhalten führen und ein Sicherheitsrisiko beinhalten. Probleme beim
Risikomanagement von NMs sind insbesondere der fehlende Konsens und die
fehlende Verfügbarkeit von geeigneten Prüfmethoden. Außerdem sind bis heute
nur für wenige NMs spezifische regulatorische Leitlinien erlassen worden. Für
die präklinische Zulassung wird der überwiegende Anteil der NMs genau wie
„reguläre“ niedermolekulare Arzneimittel reguliert. Dies erfolgt gemäß der
Leitlinie M3(R2) des Internationalen Rates für Harmonisierung technischer
Anforderungen an Pharmazeutika für den menschlichen Gebrauch. Entsprechend
M3(R2) beinhaltet die präklinische Arzneimittelzulassung: Pharmakologie, Toxi-
und Pharmakokinetik sowie Untersuchungen zur Toxizität. Für eine
Risikoeinschätzung könnten jedoch weitere Parameter benötigt werden, welche
die besonderen Eigenschaften wie beispielsweise die Partikelgröße oder
Aggregationseffekte von NMs berücksichtigen. Darüber hinaus können
Standardtests mit NMs interferieren und müssen verifiziert werden. Die
vorliegende Studie untersucht die Kinetik sowie die akute und subakute
Toxikopathologie von dPGS und trägt somit zu einer Grundlage für weitere
Forschung in Richtung Arzneimittelzulassung bei. In vorangegangenen
Wirksamkeitsstudien gegen Entzündungen zeigten fluoreszenzmarkierte dPGS in
vivo keine offensichtlichen akuten Nebenwirkungen. Soweit war die Beurteilung
der biomedizinischen Anwendbarkeit von dPGS sehr vielversprechend, jedoch
lagen keine systematisch erhobenen Daten gesunder Tiere vor, welche die
Verteilung, Ausscheidung und Histopathologie als übliche Bestimmungsgrößen
einer präklinischen Sicherheitsbewertung berücksichtigen. Außerdem wird
angenommen, dass eine Fluoreszenzmarkierung die Eigenschaften eines NP
verändert, so zu einer abweichenden Bioverteilung führt und folglich eine
Verifikation erfordert. Darüber hinaus erlaubt die Fluoreszenzmarkierung keine
histopathologische Beurteilung. Geeignete Techniken, um „weiche“ NPs wie dPGS
in vivo nachzuweisen, sind allerdings nur begrenzt vorhanden. Aufgrund ihrer
geringen Größe entziehen sich alle NPs der Wellenlänge des Lichts und
benötigen eine Markierung, um unter dem Lichtmikroskop sichtbar zu sein. Die
niedrige Atomzahl „weicher“ NPs schließt jedoch auch den Einsatz der
Elektronenmikroskopie aus. Es gibt innovative Methoden, wie beispielsweise die
Raman-Spektroskopie, die keine Markierung benötigen, mit denen man NPs in
Zellen lokalisieren sowie zelluläre Veränderungen beurteilen kann. Diese haben
jedoch den Nachteil, technisch anspruchsvoll und nicht allgemein verfügbar zu
sein. Eine Alternative zur Markierung mit Fluorophoren ist die Markierung mit
Radioisotopen. Sofern das Isotop gut integriert ist, bleibt die chemische
Struktur des NP dabei erhalten. Die Strahlung kann mit der Ganzkörper- /
Ganzorganautoradiographie (WBA/WOA) aufgezeichnet werden oder dazu verwendet
werden, um quantitative kinetische Studien mit der quantitativen Ganzkörper- /
Ganzorganautoradiographie (QWBA/QWOA) sowie mit der
Flüssigszintillationszählung (LSC) durchzuführen. Diese Techniken stellen
jedoch nur Daten auf Gewebeebene bereit. Um radioaktiv markierte NPs in Zellen
nachzuweisen, wurde in diesere Studie die lichtmikroskopische Autoradiographie
(LMA) etabliert. Die LMA lässt auch eine simultane histopathologische
Untersuchung zu. Das Radioisotop 35S wurde eigens für diese Studie in den dPGS
NP integriert. Weil Schwefel ein Bestandteil von dPGS ist, war dieses Isotop
besonders geeignet. Zu beachten ist, dass funktionelle Aminogruppen für eine
einfache Konjugation mit Farbstoffen oder Arzneimitteln eingefügt wurden. Das
daraus resultierende radioaktive dPG35S amine wurde gesunden Mäusen i.v. oder
s.c. verabreicht. Die Mäuse wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der
Applikation getötet, aber nicht entblutet und Proben für die LSC und die
Autoradiographie (WOA, QWOA und LMA) wurden entnommen. Die dPG35S amine
Konzentration in Leber und Milz stieg bis zum Tag 5 bzw. Tag 21 nach der i.v.
Applikation an. Bei der Untersuchung von Gewebeschnitten mit der LMA wurde
dPG35S amine in den Kupffer Zellen der Leber sowie in der roten Milzpulpa 24
Stunden, 5 und 21 Tage nach seiner Verabreichung lokalisiert. In anderen
Organen wie Niere, Lunge, Darm, Hoden und Gehirn nahm die dPG35S amine
Konzentration gesamt gesehen über die Zeit ab. Dabei wurden nur geringe
Konzentrationen in den Hoden und nur marginale Konzentrationen im Gehirn
gemessen, was auf eine dichte Blut-Gewebe-Schranke für diesen NP hindeutet.
Des Weiteren wurde dPG35S amine im Kot und zu den frühen Zeitpunkten auch im
Urin nachgewiesen. Diese Daten legen zusammengenommen zwar eine partielle
Ausscheidung über Leber und Niere nahe, aber davon abgesehen wird dPG35S amine
im Mononukleären Phagozytensystem (MPS) zurückbehalten. Partikel, die in
Makrophagen nicht rasch degradiert werden, werden sequestriert, wie es für
dPG35S amine durch die LMA bestätigt wurde. Auch die lange, vermutlich
terminale Halbwertszeit von dPG35S amine von über 12 Tagen weist auf eine
Retention hin. Abgesehen von einem verzögerten Einsetzen der Verteilung dieses
NP in die Organe nach s.c. Applikation, war diese der Verteilung nach i.v.
Applikation sehr ähnlich. In der vorliegenden Studie zeigten sich weder in
klinischen Untersuchungen während des Experiments noch durch makro- oder
histopathologische Beurteilung des untersuchten Gewebes Nebenwirkungen. Vom
pathomorphologischen Standpunkt aus gibt es daher keine Hinweise, die gegen
eine weitere Erforschung von dPGS für biomedizinische Zwecke sprechen. Die
Anreicherung von dPGS in MPS Zellen, welche auch für andere geladene NPs
bekannt ist und von der Proteinkorona des NP abhängt, beinhaltet hingegen
immer das Risiko einer Toxizität, wodurch eine Anwendung als Therapeutikum
oder Diagnostikum schwierig wird. Außerdem können zurückgehaltene NPs mit
diagnostischer Bildgebung interferieren. Die Retention von dPGS in MPS Zellen
wird daher in Toxizitätsuntersuchungen durch Langzeit- und
Mehrfachapplikationen sowie in allen zukünftigen Bestrebungen, dPGS für die
biomedizinische Anwendung zu entwickeln, berücksichtigt werden müssen.
de
dc.format.extent
X, 76 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
anti-inflammatory agents
dc.subject
tissue distribution
dc.subject
liquid scintillation counting
dc.subject
autoradiography
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft
dc.title
Anti-Inflammatory Dendritic Polyglycerol Sulfate Nanoparticle:
Biodistribution, Elimination, Cellular Localisation and Toxicopathology in
Mice
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Achim D. Gruber, Ph.D. (Cornell Univ.)
dc.contributor.furtherReferee
Univ. Prof. Dr. Dr. Ralf Einspanier
dc.contributor.furtherReferee
Univ. Prof. Dr. Mahtab Bahramsoltani
dc.date.accepted
2017-06-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000105583-1
dc.title.translated
Entzündungshemmender dendritischer Polyglycerol Sulfat Nanopartikel:
Bioverteilung, Ausscheidung, zelluläre Lokalisierung und Toxikopathologie bei
Mäusen
de
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000105583
refubium.note.author
Aus Copyrightgründen sind die Zeitschriftenartikel online nicht
veröffentlicht.
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000022373
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access