Einfluss nukleärer Östrogenrezeptoren auf die Expression der Adipozytären Triglyceridlipase

Abstract

Östrogenrezeptoren (ERs) spielen eine wichtige Rolle bei metabolischen Prozessen im Fettgewebe. Es existieren geschlechtspezifische Unterschiede bezüglich der Lipolyse. Beispielsweise ist bekannt, dass weibliche Mäuse unter körperlicher Belastung männlichen Artgenossen gegenüber vermehrt Energie aus der Oxidation von Lipiden gewinnen. Weiterhin ist bekannt, dass Veränderungen der Fettverteilung und der metabolischen Aktivität des Fettgewebes während der Menopause mit einem steigenden Risiko für metabolische und kardiovaskuläre Erkrankungen beim Menschen assoziiert sind. Die Charakterisierung molekularer Mechanismen der Östrogenwirkung im Fettgewebe könnten daher zum Verständnis und der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien in der Behandlung metabolischer Erkrankungen beitragen. Diese Arbeit untersucht den Einfluss der nukleären Östrogenrezeptoren (alpha and beta auf die Expression der Adipozytären Triglyzerid Lipase (ATGL), dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym im Prozess des Triglyzeridabbaus. Methoden und Ergebnisse: Der regulatorische Einfluss von ERalpha and ERbeta auf die Expression der ATGL wurde in 3T3L1-Präadipozyten auf Promotor-, mRNA- und Proteinlevel untersucht. Die Zellen wurden transient mit ERalpha/ERbeta oder PSG5 transfiziert und mit Vehikel vs. selektivem ERalpha/ERbeta Agonisten PPT/DPN (c=100nM) über 24h stimuliert. Die Promotoraktivität der Sequenz 3000bp upstream des ersten Exons des ATGL-Gens wurde mittels Luziferase-Assay untersucht. Die Transkription stieg sowohl ligandenunabhängig unter der Überexpression von ERalpha/ERbeta(1.6-/2.5-fach, p<0.05 vs. PSG5-Kontrolle), als auch unter Rezeptorüberexpression bei gleichzeitiger Stimulation mit dem jeweiligen selektiven Agonisten an (2.7-/3.3-fach, p<0.05 vs. Vehikel). Die bioinformatische Promotoranalyse zeigte in Einklang mit diesen Ergebnissen 7 putative ERbeta- und nur 1 putatives ERalpha- Bindungmotiv. Die quantitative Real-time PCR zeigte einen signifikanten Anstieg der ATGL-mRNA-Menge um den Faktor 1,3 unter Vehikel- und den Faktor 1,5 unter PPT-Stimulation für ERalpha überexprimierte Zellen gegenüber PSG5-Kontrollen (both p<0.05). Entsprechende Experimente für die Überexpression von ERbeta zeigten einen signifikanten Anstieg der ATGL-Menge um den Faktor 3,5 in DPN-stimulierten Zellen gegenüber PSG5-Kontrollen (p<0.05). Außerdem konnte in ERalpha-überexprimierten Zellen ein signifikanter Anstieg um den Faktor 2.3 in DPN-stimulierten Zellen gegenüber Vehikelstimulierten Zellen gezeigt werden (p<0.05). Es wurde ein signifikanter 2-facher Anstieg der ATGL-mRNA in PSG5-Kontroll-Zellen beobachtet (p<0.05), der am ehesten auf einen geringen endogenen ERbeta-Besatz zurückzuführen ist. Western Blot Versuche zeigten unter Stimulation mit DPN einen Anstieg der ATGL Menge sowohl in Kontrollzellen, als auch in ERbeta- überexprimierten Zellen. Unter PPT Stimulation zeigten sich keine überzeugenden entsprechenden Effekte für Kontroll- oder ERalpha- überexprimierte Zellen. Schlussfolgerungen: Die vorliegende Arbeit zeigt, dass beide ERs die Expression der ATGL steigern. Der Einfluss von ERbeta auf die ATGL-Promotoraktivität, -mRNA-Expression und –Proteinmenge war in den vorliegenden Experimenten starker ausgeprägt, als derjenige von ERalpha. In weiterführenden Experimenten ist die Bedeutung dieser Beobachtungen für eine ER-spezifische Regulation der Lipolyse zu klären.

Estrogen Receptors (ERs) are known to play an important role in the metabolic functions of adipose tissue (AT). Gender specific differences concerning lipolysis have been reported. For instance, female mice are known to mobilize energy from fat more efficiently than male littermates under exercise conditions. Also, changes in fat distribution and metabolic activity of adipose tissue during menopause are associated with an increasing risk for metabolic and cardiovascular complications in humans. The characterization of molecular mechanisms of estrogen-action in AT might help understand and treat metabolic disorders in the future. This study investigates the impact of nuclear ERs (alpha and beta on the expression of the Adipose Triglycerid Lipase (ATGL), the rate-limiting lipolytic enzyme in the process of triglyceride-degradation. Methods and Results: The regulatory impact of ERalpha and ERbeta on the expression of ATGL was investigated in 3T3L1-preadipocytes on promoter-, and mRNA level. Cells were transiently transfected with ERalpha/ERbeta or PSG5 and stimulated with vehicle vs. selective ERalpha/ERbeta agonists PPT/DPN (c=100nM) for 24h. Promoter-activity of the sequence 3000bp upstream of the first exon of the ATGL-gene was assessed by performing luciferase assay. Transcription increased both ligand- independently under the overexpression of ERalpha/ERbeta (1.6-/2.5-fold, p<0.05 vs. PSG5-control), as well as under receptor-overexpression and stimulation with the respective ER-agonist (2.7-/3.3-fold, p<0.05 vs. vehicle). In accordance, bioinformatical promoter analysis performed on the murine sequence revealed 7 putative ERbeta- and only 1 putative ERalpha- binding site. qRT-PCR-analysis demonstrated a significant increase in the amount of ATGL-mRNA by factor 1.3 under vehicle- and factor 1.5 under PPT- stimulation for cells overexpressing ERalpha vs. PSG5-control (both p<0.05). Similar experiments for the overexpression of ERbetashowed a significant increase in ATGL-mRNA-amount by factor 3.5 in DPN-stimulated cells vs. PSG5-control (p<0.05). Additionally, in cells overexpressing ERbeta a significant increase by factor 2.3 could be observed between vehicle- and DPN- stimulation (p<0.05). Most likely attributable to endogenous ERbeta a significant 2-fold increase of ATGL-mRNA could be observed under DPN- stimulation in PSG5-control-cells (p<0.05). Western Blot showed an increase in the amount of ATGL for both control-cells, as well as cells overexpressing ERbeta when stimulated with DPN. PPT stimulation did not show conclusive corresponding effects in control-cells or cells overexpressing ERalpha Conclusions: The present study demonstrates that both ERs exert positive regulatory actions on the expression of ATGL. The impact of ERbeta on ATGL promoter-activity, mRNA-expression and protein amount appears to be stronger when compared to ERalpha Further experiments will be required to determine the importance of these finding for an ER isoform-specific regulation of lipolysis.