Glutamate receptors are the fundamental mediators of electrical excitatory signals between the principal neurons of all known central nervous systems. Most glutamatergic synapses onto principal neurons of the brain form specifically on small protrusions, called spines, from long dendritic extensions of neuron cell bodies (Boyer et al., 1998). The NMDA receptor is the only voltage-gated glutamate receptor of the central nervous system. In vertebrates the variety of the regulatory subunits of the GluN2 family has led to a diversity of enzymes in the synaptic signalling machine that became tightly linked to cytosolic NMDA receptor domains (Kennedy, 2000; Ryan et al., 2013). The most common GluN2 subunit paralogs in the forebrain are GluN2A and GluN2B (Paoletti et al., 2013). Activity of the small GTPase Arf6 is frequently implicated in cellular processes, when membranes, the cytoskeleton, and vesicular trafficking need to be modified in concert (Donaldson, 2003; Myers and Casanova, 2008). During neuron development, Arf6 plays also a role in spine formation (Miyazaki et al., 2005; Raemaekers et al., 2012). Amongst Arf6 regulators, EFA6A, BRAG1 and BRAG2 were shown to be abundant in glutamatergic synapses (Choi, 2006; Lowenthal et al., 2015). BRAG1 and BRAG2 also affect the size of glutamate receptor membrane currents from mature neurons of the hippocampus after electrical stimulation (Scholz et al., 2010; Myers et al., 2012). In this study interactions between NMDA receptors and BRAG1 or BRAG2 will be investigated for a possible role in synaptic activation of Arf6 in dendritic spines on principal neurons of the neocortex. Protein levels of GluN2A, BRAG1 and BRAG2 increased during neuronal maturation. After NMDA receptor ligand binding, GluN2B-BRAG1 signalling was identified as the predominant route of elevating Arf6 GDP/GTP-exchange in young neurons, while GluN2A-BRAG2 signalling could be assigned to mature neurons. Calcium influx through the ion channels of NMDA receptors was necessary for the changes in active Arf6 levels. Depleting BRAG1 abolished NMDA receptor-triggered Arf6 activation in young neurons. The absence of BRAG2 only affected mature neurons. BRAG2 depleted neurons lacked the control of GluN2A-containing receptors over Arf6 and bore a high-level Arf6 activation tone via a return to the GluN2B-BRAG1 signalling route, comparable to young neurons in culture. The absence of BRAG2 affected the morphology of dendritic spine populations of principal layer 5 neurons in the parietal neocortex of conditional BRAG2 knockout mice. Protein interaction assays suggested that BRAG1 and BRAG2 are constituents of the NMDA receptor complex. Physical binding to BRAG proteins was mediated by interactions at central regions of the cytosolic receptor segments. Segments of the BRAG proteins between the amino-terminus and the catalytic domain mediated the subtype-selective binding to GluN2 subunits. GluN2 subunit-BRAG protein interactions were sensitive to ambient calcium concentrations, and functional regulation of BRAGs was tied to interaction with calmodulin, as proposed elsewhere (Myers et al., 2012). The essential results of this dissertation contributed to a study, in which further functional aspects of neuronal BRAG-mediated Arf6 activation were elaborated (Elagabani et al., 2016). NMDA receptor- triggered BRAG GEF-activity might modulate active Arf6 levels according to neuronal excitability and maturational stages, and connect Arf6 functions with synaptic plasticity. The described signalling pathways regulating Arf6 activation might be involved in (1) the modification of spine membrane composition, (2) cytoskeletal remodelling, and (3) amongst other synaptic proteins, AMPA and NMDA receptor trafficking.
GLUTAMAT-REZEPTOREN vermitteln die grundlegende Signalübertragung erregender Nervenzellen zentraler Nervensysteme. Die neuronalen Verknüpfungen zu pyramidalen Projektionsneuronen werden hauptsächlich über glutamaterge Synapsen an dornenförmigen Fortsätzen, den Spines, ihrer Dendriten gebildet (Boyer et al., 1998). NMDA-Rezeptoren sind spannungsabhängige Glutamat- Rezeptoren. Die Vielfalt der regulatorischen NMDA-Rezeptor Untereinheiten der Familie GluN2 führte in Wirbeltierhirnen zur Entstehung von unterschiedlichen Rezeptor-assoziierten Signalproteinkomplexen (Kennedy, 2000; Ryan et al., 2013). Die am häufigsten vorkommenden regulatorischen NMDA-Rezeptor Untereinheiten im Vorderhirn sind GluN2A und GluN2B (Paoletti et al., 2013). Durch die Einbindung der kleinen GTPase Arf6 werden zelluläre Abläufe an Membranen, am Zytoskelett und im vesikulären Transportsystem auf einander abgestimmt (Donaldson, 2003; Myers and Casanova, 2008). Während der neuronalen Entwicklung trägt Arf6 zur Bildung von dendritischen Spines bei (Miyazaki et al., 2005; Raemaekers et al., 2012). Zu den stark angereicherten Proteinen glutamaterger Synapsen unter den Arf6-Regulatoren gehören EFA6A, BRAG1 und BRAG2 (Choi, 2006; Lowenthal et al., 2015). BRAG1 und BRAG2 sind im Stande die Stärken von evozierten Membranströmen an Synapsen adulter Neuronen des Hippocampus zu beeinflussen (Scholz et al., 2010; Myers et al., 2012). Die vorgelegte Studie untersuchte Wechselwirkungen zwischen NMDA- Rezeptoren und BRAG1 oder BRAG2, um Mechanismen zur Aktivierung von Arf6 an neuronalen Synapsen zu erforschen. Die Expression von BRAG1, BRAG2 und GluN2A steigerte sich im Laufe der neuronalen Entwicklung. In Neuronenkulturen steigerten durch Liganden-Bindung zwei getrennte Signalwege den GDP/GTP- Austausch von Arf6, der GluN2B-BRAG1 Signalweg in jungen Neuronen und der GluN2A-BRAG2 Signalweg in reifen Neuronen. Die Änderungen des Arf6 Aktivitätsniveaus verlangten einen Kalziumeinstrom durch den Ionenkanal des NMDA-Rezeptors. Beim Fehlen von BRAG1 in jungen Kulturen konnten NMDA-Rezeptoren keine Arf6 Aktivierung verursachen. Das Fehlen der BRAG2 Expression beeinflusste Neuronen hingegen nur im reifen Stadium. Ohne BRAG2 Expression blieb in reifen Neuronenkulturen der Einfluss von GluN2A-haltigen Rezeptoren auf die Arf6 Aktivierung aus, und die Konzentration von Arf6-GTP erhöhte sich durch eine Rückkehr zum GluN2B-BRAG1 Signalweg. In diesem Zustand war das Arf6 Aktivitätsniveau mit dem in jungen Neuronen vergleichbar. Das Fehlen von BRAG2 in Knockout-Mäusen hatte außerdem Auswirkungen auf die morphologischen Maße von Spines auf pyramidalen Neuronen der Zellschicht 5 im parietalen Kortex. Die Untersuchungen der Proteinbindungen legten nahe, dass BRAG1 und BRAG2 funktionelle Bestandteile des NMDA-Rezeptor Komplexes sind. Die Wechselwirkung zwischen BRAG Proteinen und GluN2- Untereinheiten erfolgte über mittig in den zytosolischen Rezeptorsegmenten liegende Regionen. Aminoterminal zur katalytische Domäne liegende Bereiche in BRAG1 und BRAG2 vermittelten die spezifische Bindung an die GluN2-Untereinheiten. Die GluN2-BRAG Bindung wurde durch die eingestellte Kalziumkonzentration beeinflusst, sodass die Regulierung der BRAG GEF-Funktion mit Calmodulin in Verbindung stehen könnte. Wesentliche Resultate dieser Arbeit sind Bestandteil einer kürzlich erschienenen Publikation, die auch weitere Funktionen der beschriebenen Arf6 Aktivierung näher veranschaulicht (Elagabani et al., 2016). Über NMDA-Rezeptoren könnte der BRAG GEF-Mechanismus den Bedarf an aktivem Arf6 den neuronalen Erregungs- und Entwicklungsstadien anpassen und ein enger Zusammenhang zur Plastizität der Stärken von Synapsen bestehen. Die hier beschriebenen Signalwege zur Regulation von Arf6 könnten Einfluss nehmen auf (1) die Zusammensetzung der Spine-Membran, (2) die Umstrukturierung des dort befindlichen Zytoskeletts und (3) die Umverteilung synaptischer Proteine wie AMPA- und NMDA- Rezeptoren.
