Funktionelle und molekulare Charakterisierung des Humanen Endogenen Retrovirus K113

Abstract

Das Humane Endogene Retrovirus K113 ist das vollständigste HERV, welches derzeit bekannt ist. Es besitzt offene Leserahmen für alle viralen Proteine und liegt in ca. 15 % der menschlichen Bevölkerung integriert auf Chromosom 19 vor. Um dieses Provirus molekular und funktionell zu charakterisieren, wurde das komplette Genom in einen eukaryontischen Plasmidvektor kloniert. Durch die substantiell vorhandene LTR-Promotoraktivität des Provirus konnte die Transkription genauer untersucht werden. Zusätzlich war es möglich in mit dem Molekularklon transfizierten Zellen einzelne virale Proteine nachzuweisen. HERV-K113 ist nicht replikationskompetent, unter anderem besitzt das Provirus inaktivierende Mutationen in dem Reverse Transkriptase (RT) Gen. Die RT kann zwar durch Reversion dieser Mutationen wieder aktiviert werden, jedoch ist dies nicht ausreichend, um die Replikationskompetenz des Virus wieder herzustellen. Ebenfalls besitzt das Provirus ein nicht-funktionelles Oberflächenprotein. Durch Rückmutationen von postinsertionellen Aminosäure- Änderungen, identifiziert durch Sequenzvergleiche mit anderen Proviren der HERV-K(HML-2) Familie, konnte hier jedoch das ursprüngliche HERV-K113 Oberflächenprotein rekonstituiert werden. Unterstützend durch eine Kodonoptimierung konnte gezeigt werden, dass das rekonstruierte Env seine Fähigkeit wiedererlangt hat in Partikel eingebaut zu werden und den Eintritt des Virus in die Zelle initialisiert. Zusätzlich wurden die Verbesserung des Einbaus bei der Pseudotypisierung von lentiviralen Vektoren und die Erhöhung der Fusogenität durch carboxyterminale Verkürzungen des Env festgestellt. Für Replikationsuntersuchungen eines weiteren endogenen Retrovirus, dem XMRV (Xenotropic Murine Leukemia Virus-related Virus), welches als exogenes Virus offenbar den Menschen infizieren kann, wurde zunächst eine Prävalenz-Studie in deutschen Prostatakrebspatienten durchgeführt. Jedoch konnten weder auf DNA- und RNA-Ebene XMRV-spezische Sequenzen noch in getesteten Serum-Proben spezifische Antikörper detektiert werden.

The human endogenous retrovirus is the most complete HERV known to date. It contains open reading frames for all viral proteins and is integrated on chromosome 19 in about 15% of the human population. For the molecular and functional characterization of this provirus, the complete genome was cloned into a small plasmid vector. Via the substantial LTR-promoter activity the transcription of the provirus could be shown. In addition, it was possible to detect nearly all viral proteins in cells transfected with the molecular clone. HERV-K113 is not replication competent. It carries inactivating mutations in the reverse transcriptase gene. These mutations can be reversed to reconstitute the active enzyme, but the reversion is not sufficient to reconstitute replication capacity of the virus. Additionally, the virus carries a non-functional surface protein. By back mutating putative postinsertional amino acid changes, which were identified via sequence analysis with other proviruses of the HERV-K(HML-2) family, the ancestral envelope protein could be reconstituted. Aided by codon-optimized expression, it could be shown that this reconstituted Env regained its ability to be incorporated into retroviral particles and to mediate entry. For replication analysis of another endogenous retrovirus, the XMRV (Xenotropic Murine Leukemia Virus-related Virus), which is obviously able to infect human cells, a prevalence study of German prostate cancer patients was done. However, XMRV specific sequences were detected at neither the DNA nor the RNA level. Consistent with this result, none of the sera analyzed from prostate cancer patients contained XMRV-specific antibodies.