Subletale Wirkungen von Oxalsäure in Kombination mit Zuckerwasser oder Glycerin auf Apis mellifera: Untersuchung der Toxizität, der Pharmakodynamik, des Verhaltens und der Lebensdauer, sowie der Rückstände auf Bienen und Beutenmaterial

Abstract

Die durch die parasitäre Milbe Varroa destructor ausgelöste Varroose stellt heute eines der größten Probleme in der Bienenzucht und –haltung dar. Um die Anzahl der Parasiten im Bienenvolk unterhalb der Schadensschwelle zu halten und eine Ausbreitung der Milben zu vermeiden, müssen die Völker vom Imker gegen die Varroose behandelt werden. Oxalsäure als Wirkstoff stellt eine wichtige Komponente dieser Behandlungen dar. In meiner Diplomarbeit konnte ich bereits subletale Effekte der Säure auf die Bienen zeigen. Da das Medikament in der Praxis durch Kombination von Oxalsäuredihydrat mit Zuckerwasser angesetzt wird, kann eine orale Aufnahme der Lösung durch die Bienen nicht ausgeschlossen werden. Diese kann zu einer erhöhten Mortalität durch die orale Toxizität der Säure führen und somit die Effekte der Säure auslösen oder verstärken. Um Bienen von den nicht auszuschließenden Nebenwirkungen beim breiten Einsatz des Medikamentes zu schützen und Nachteile für die Völker auszuschließen, war es das Ziel dieser Arbeit die subletalen Effekte der klassischen Behandlung mit Oxalsäuredihydrat in Kombination mit Zuckerwasser (OAS) aber auch in Kombination mit dem Zuckerersatzstoff Glycerin 45% (OAG) auf das Volk und die Einzelbiene in einem möglichst weiten Spektrum zu erfassen. Für alle Versuche, mit Ausnahme der Rückstanduntersuchungen am Volk, wurden die Bienen individuell im Labor behandelt. Dabei erhielt jede Biene 5µl OAS bzw. OAG auf die Unterseite des Abdomens aufgeträufelt (Oxalsäuredihydrat Dosis:175µg/Biene). Die Kontrollen erhielten Glycerin 45% (G) oder Zuckerwasser (K). In der Arbeit wurden möglichst verschiedene Parameter untersucht: Für Veränderungen in Futteraufnahme wurden Honigblase, Mittel- und Enddarm präpariert und auf einer Feinwaage gewogen (n=80) sowie die Futteraufnahme pro Tier in Einzelfütterungen ermittelt (n=125). Die Empfindlichkeit gegenüber Wasser und aufsteigende Zuckerkonzentrationen wurde mit Hilfe der Proboscis Extension Reaction (PER) überprüft (n=100). Die motorische Aktivität der Tiere wurde in einer vertikal aufgestellt, von oben beleuchtet Box untersucht aufgenommen (n=40). In einem Schauvolk wurden Verhalten und Lebensdauer unter volksähnlichen Bedingungen erfasst. Parallel dazu wurde die Lebensdauer auch unter Laborbedingungen aufgenommen (n=100). Die Aufnahme des Flugverhaltens erfolgte mit Radio Frequenz Identifikation, mit der Daten über das Aus- und Heimflugverhalten der Bienen gesammelt wurden (n=100). Neben den subletalen Effekten der Säure wurden auch ihre Rückstände auf der Einzelbiene optisch unterm Binokular und quantitativ mit dem Oxalsäure-Kit Enzytec™ erfasst (n=60). Durch Computertomographie erfolgten die Visualisierung der Verteilung im Volk und Dichtemessungen an der Einzelbiene (n≤600). Die Behandlung mit Oxalsäure verursachte für beide Formulierungen subletale Effekte auf Apis mellifera. Diese äußerten sich in einer veränderten Futteraufnahme, einem erhöhten Wasserbedarf, Veränderungen im Flugverhalten und einer verkürzten Lebensdauer unter Labor- sowie volksnahen Bedingungen. Auf die Motorik und phototaktische Aktivität der Biene hatte die Behandlung keinen Einfluss. Bei den Beobachtungen im Schauvolk konnten Veränderungen im Stockverhalten, wie sie in der Diplomarbeit für OAS beobachtet wurden, für die Formulierung Oxalsäure in Glycerin 45% nicht nachgewiesen werden. Die erhöhte Sensibilität auf Wasser 24h nach Behandlung (p≤0,004; Mc Nemar’s Test) lässt eine Übersäuerung der Bienen vermuten, die sie durch vermehrte Wasseraufnahme versuchen auszugleichen und spiegelte sich in der gesteigerten Aufnahme von Zuckerwasser in den Einzelfütterungen (Versuch: Veränderungen in der Futteraufnahme) wieder (p≤0,005, H≥20, DF=3, Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks). Die Aufnahme festerer Nahrung, wie Futterteig war dagegen zum Teil verringert (p≤0,001, H≥72,609, DF=3, Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks). Die Veränderungen im Flugverhalten zeigten sich in einer verringerten Ausflugsrate sieben Tage nach Behandlung (p≤0,03, t≥2,83, paired t-test) und einem verringerten Anteil an Flugbienen (p≤0,043, z≥2,024, z-test). Zusammen mit der verkürzten Lebensdauer im Labor (p≤0,001, Statistik-Wert=355,577, DF=3, Kaplan-Meier Survival Analysis Gehan-Breslow) und Schauvolk (p≤0,003, Statistik-Wert=11,852, DF=2, Kaplan-Meier Survival Analysis Gehan-Breslow) weisen die Ergebnisse auf eine allgemeine Beeinträchtigung der Tiere nach der Behandlung hin, die unterschiedlich ausgeprägt sein kann und sich nicht in allen Versuchsdurchgängen manifestierte. Der genaue Wirkmechanismus der Oxalsäure auf die Biene ist nicht bekannt. Da die gefundenen Effekte auch bei der Kombination mit Glycerin auftreten, ist nicht davon auszugehen, dass sie über eine Ingestion durch Auflecken der Säure durch die Biene verursacht werden, da Bienen Glycerin nicht freiwillig aufnehmen. Somit unterstützen die Ergebnisse die Vermutungen von Nozal, dass die Säure durch die Kutikula dringt. Dies würde auch die erhöhte Mortalität der Jungbienen (p≤0,033, z≥2,131, z-Test), die durch ihre nach weichere Kutikula empfindlicher reagiert haben könnten, erklären. Neben diesen Effekten wurde ein verstärktes Putzen nach Applikation beider Formulierungen beobachtet (p≤0,009, H≥13,398, DF=4, Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks), welches bei Bienen, die mit Oxalsäure in Zuckerwasser behandelt waren, länger anhielt. Während sich Oxalsäure in Glycerin schnell und gleichmäßig auf dem Körper der Bienen verteilt und nicht auftrocknet, bildet die Oxalsäure in Zuckerwasser beim Auftrocknen Kristalle und ein Grund dafür sein können, dass das Putzen der Bienen der OAS Gruppe länger anhielt Im Computertomographen zeigte die Visualisierung der Verteilung beider Formulierungen eine erhöhte Dichte der Einzelbienen bis zu zwei Wochen nach Behandlung (p≤0,001, H≥195,198, DF=3, Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks), die im OAG Volk über die Zeit nicht abnimmt und auf ein Vorhandensein der Säure im Volk hinweist. Ergänzend dazu waren Rückstände der Oxalsäure bis zu zwei Wochen auf den Bienen im Volk und bis zu fünf Wochen auf dem Material mit den Enzym-Kits nachweisbar. Das bedeutet, dass Bienen auch lange nach der Behandlung noch mit der Wirksubstanz in Kontakt kommen können. Da Oxalsäure als Winterbehandlung im November/Dezember eingesetzt wird, sind vor allem die langlebigen Winterbienen betroffen, deren Überleben ausschlaggebend für den erfolgreichen Start des Volkes ins Frühjahr ist. Eine verkürzte Lebensdauer konnte auch unter volksnahen Bedingungen wie bei den Beobachtungsversuchen und der Untersuchung des Flugverhaltens festgestellt werden. Es ist denkbar, dass dieser Effekt der Behandlung auf vitalen Bienen im Volk schwächer ausfällt, da es in der Lage ist Effekte bis zu einem gewissen Grad abzupuffern. Die in dieser Arbeit belegten subletalen Effekte der Oxalsäure auf Apis mellifera können die Gesundheit des Bienenvolkes beeinträchtigen, da eine Schädigung des Individuums auch immer Auswirkungen auf die Gruppe hat. Diese Nebenwirkungen stehen der akarizide Wirksamkeit der Oxalsäureapplikation am Volk gegenüber. Die Vorteile der Effektivität von Oxalsäure gegen die Milbe überwiegen die Nachteile. Alternativ einzusetzende Präparate weisen gegenüber Oxalsäure erhebliche Nachteile auf. Die Erkenntnisse dieser Arbeit helfen, die Auswirkungen der Behandlung auf die Völker besser einschätzen zu können und bilden den Ausgangspunkt für eine Optimierung des Tierarzneimittels. Ohne eine Behandlung der Bienenvölker gegen den Parasiten Varroa destructor ist die Erhaltung von Apis mellifera nicht möglich.

The parasitic disease Varroosis in colonies of Apis mellifera caused by the mite Varroa destructor is one of the biggest problems in beekeeping. In order to keep the number of mites below the injury level and avoid spreading throughout the hive, beekeepers have to treat their colonies against Varroosis on a regular basis. Oxalic acid represents one of the main active components in medical treatments. By the use of sugar water as carrier substance it cannot be excluded that the bees ingest the syrup and the acaricide. This can lead to bee mortality, because of the oral toxicity of oxalic acid, and could increase possible effects of the acid. The purpose of this study was to determine the sublethal effects of the conventional treatment with oxalic acid dehydrate in sugar water (OAS) and also in combination with the sugar substitute glycerol 45% (OAG) on a colony level and the individual bee in a wide range. For all experiments, excluding the residue detections in the colonies, bees were treated individually in the laboratory with 5µl of OAS and OAG, respectively, ventral on the abdomen (dosage of oxalic acid dehydrate: 175µg/bee). Controls received glycerol 45% (G) or sugar water (S). In this work many different parameters were investigated: to find changes in the feeding behavior the crop, midgut and rectum were weighted (n=80) and the individual food uptake was determined (n=125). The bees’ sensitivity to water and ascending concentrations of sucrose solution (ACSS) was tested using the proboscis extension response (n=100). Motoric activity was investigated in an open-field-like apparatus, standing vertically and illuminated from above (n=40). In an observation hive the behavior and longevity of treated bees under field-like conditions was recorded. In addition, longevity was also investigated under laboratory conditions (n=100). The flight behavior (uptake and home coming) was examined using radio frequency identification (n=100). In addition to the investigation of sublethal effects, residues of oxalic acid on individual bees and hive material were determined optically under a binocular and quantitatively using enzymatic reaction (n=60). With computed tomography the distribution of oxalic acid was visualized and the density of bees was measured (n≤600). The treatment with oxalic acid in both formulations caused sublethal effects on Apis mellifera. These could be demonstrated in changed feeding behavior, an increased sensitivity to water, changes in flight behavior and decreased longevity. On motoric activity and phototactic behavior the treatment seemed to have no effect. Effects on the in-hive behavior, could not be detected for the formulation oxalic acid in glycerol. The increased sensitivity on water 24h after treatment (p≤0.004; Mc Nemar’s Test) indicates an acidosis of the bees, which they compensated with an increased uptake of water. This could also explain the increased uptake of sugar water in the individual feedings (p≤0.005, H≥20, DF=3, Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks). In contrast, the feeding on solid food, like sugar dough, was decreased (p≤0.001, H≥72.609, DF=3, Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks). The changes in flight behavior appeared in a decreased flight-rate seven days after treatment (p≤0.03, t≥2.83, paired t-test) and a decreased proportion of bees showing flight activity (p≤0.043, z≥2.024, z-test). Along with the decreased longevity in the laboratory (p≤0.001, statistics=355.577, DF=3, Kaplan-Meier Survival Analysis Gehan-Breslow) and observation hive (p≤0.003, statistics=11.852, DF=2, Kaplan-Meier Survival Analysis Gehan-Breslow), these results indicate a general impairment of the bees after treatment, which can vary in its’ extend and could not be detected in all trials. The exact mode of action of the oxalic acid on the bee is yet unproven. However, it seems improbable that the effects are caused through an oral uptake by the bees, since impairments could also be found for the combination with glycerol. This would support Nozal’s assumption that oxalic acid penetrates the cuticle of bees and could be an explanation for the increased mortality of young bees in this study (p≤0.033, z≥2.131, z-Test), which are more sensitive to a treatment due to their softer cuticle. Beside these effects an increased grooming behavior after application was observed for both formulations (p≤0.009, H≥13.398, DF=4, Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks) which lasted longer in the OAS group. Oxalic acid in glycerol formed a wet film around the abdomen and distributed evenly. In contrast, the formulation with sugar water formed crystals when drying which could be found on the bees’ body surface and could have provoked the prolonged selfgrooming of the OAS bees. The visualization of oxalic acid distribution with computed tomography showed an increased density of the individual bee up to 14 days after treatment with OAS and OAG resp. (p≤0.001, H≥195.198, DF=3, Kruskal-Wallis One Way ANOVA on Ranks) indicating the presence of oxalic acid at least up to this point. In addition, residues of oxalic acid could be detected up to two weeks on the individual bee and up to five weeks on hive material using enzymatic reaction. This implies possible exposure of bees to oxalic acid in the hive even long after a treatment. Oxalic acid is used in November/December and affects primarily long living winter bees which are essential for overwinter survival and a successful colony development in spring. In this study a reduced longevity could also be observed under field-like conditions, in the observation hive and the examination of flight behavior. However, it is possible, that the extent of this effect is weakened on vital bees treated in the hive due to the capability of the colony to buffer negative effects to a certain level. The sublethal effects of oxalic acid on Apis mellifera demonstrated in this study can impair the health of the bee colony since an affection of the individual will always have an effect on the whole group. These adverse effects are in contrast with the high efficacy of the oxalic acid application in the hive. The benefits of the treatment clearly predominate the drawbacks. Alternative compounds have considerable disadvantages compared to oxalic acid. The findings of this study can help to estimate the effects of the treatment on the colony and to initiate an improvement of this vetenary drug. Without a colony treatment against the parasite Varroa destructor the conservation and survival of Apis mellifera is not possible.