Analysis of T Cell Receptor-Induced Signaling Modules by Mass Spectrometry: NFAT Interactions and the CBM-Complex.

Abstract

A T cell is activated by the binding of a specific antigen to its T cell receptor. Subsequently, signaling modules integrate information from the antigen receptor, environment and cellular background to produce an adequate outcome. Mechanistically, the activation of diverse transcription factors drives and shapes the cellular reaction in most cases. The transcription factors nuclear factor of activated T cells (NFAT) and nuclear factor of κ light chain enhancer of activated B cells (NFκB) play a pivotal role in T cell biology. Aberrations in their activation pathways can lead to immunodeficiency, autoimmune diseases and cancer development. A complex that consists of CARMA1, BCL10 and MALT1 (CBM-complex) controls the activation of NFκB following TCR ligation by integrating input from different signaling pathways (PKCθ, calcineurin). Employing a combination of co-immunopurification with mass spectrometry, we identified HOIP and HOIL1, two compounds of the linear ubiquitin assembly complex LUBAC, as so far unknown interactors of BCL10. We proved that HOIP interacts with BCL10 after TCR stimulation in Jurkat cells and after PMA/ionomycin stimulation in primary T helper cells. The presence of HOIP, but not its enzymatic activity, is necessary for complete NFκB activation after TCR/co-receptor engagement; a finding that was revealed in recent reports from other groups. Thus, HOIP constitutes a new potential target to modulate T cell activation. However, it remains unclear how LUBAC components are recruited to the CBM signaling complex and how they contribute to the activation of IKK and NFκB. The activation of NFAT transcription factors is a hallmark of T cell activation and a pre-requisite for most T cell effector functions. NFAT readily interacts with other transcription factors. These interactions strongly influence the locus and the outcome of NFAT binding. Via binding to the IL-2 promoter, NFAT in a complex with AP1 promotes IL 2 expression, while a complex of NFAT and FOXP3 represses IL-2 expression. In the absence of interaction partners, NFAT binding to this locus is not detectable. By combining co-immunopurification with mass spectrometry, we identified more than 100 potential previously unknown interaction partners of NFATc1 and NFATc2, including more than 40 transcription factors. We could confirm a range of these interactions in follow-up experiments, including those with Ikaros, CREB1 and RUNX1. Additionally, we identified potential common binding motifs of NFAT with these transcription factors by the use of bioinformatics. Thereby, we found that dimeric NFAT-RUNX and NFAT-CRE binding motifs are highly enriched within genomic regions of NFAT binding in activated cytotoxic T cells. Further experiments, including ChIP-Seq and molecular interaction studies, will reveal how NFAT concerts T cell functions within different T cell subsets and how other proteins influence NFAT’s activity to shape the outcome of T cell activation. This may advance the development of more specific immune- modulatory treatments.

T-Zellen werden durch die Bindung eines spezifischen Antigens über ihren T -Zell-Rezeptor (TZR) aktiviert. Die vom Antigenrezeptor kommenden Signale werden in Signalkomplexen verarbeitet, mit zusätzlichen Informationen zu Umgebung und Zellstatus versehen und integriert, um eine adäquate Reaktion der Zelle auszulösen. Diese Reaktion wird in vielen Fällen durch die Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren ausgelöst und moduliert. Die Transkriptionsfaktoren Kernfaktor in aktivierten T-Zellen (NFAT) und Kernfaktor des κ-Leichtkettenverstärkers in aktivierten B-Zellen (NFκB) spielen eine entscheidende Rolle bei der T-Zellaktivierung. Anomalien in deren Regulierung führen zu Immundefekten, Autoimmunerkrankungen und Krebs. Die NFκB-Aktivierung nach TZR-Stimulation wird vom CBM-Komplex (für CARMA1-BCL10-MALT1-Komplex) durch die Integration der Einträge verschiedener Signalwege kontrolliert. Durch Kombination von Co-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnten wir die Proteine HOIP und HOIL1, die Teil des Ubiquitin-Ligase-Komplexes LUBAC sind, als Interaktionspartner von BCL10 identifizieren. Wir konnten zeigen, dass HOIP nach Stimulation sowohl in Jurkat-Zellen als auch in primären humanen T-Helferzellen mit BCL10 interagiert. Das Vorhandensein von HOIP – nicht aber dessen katalytische Aktivität – ist für eine komplette NFκB-Aktivierung nach T-Zellaktivierung essentiell, wie kürzlich erschienene Arbeiten anderer Gruppen offenbart haben. Somit ist HOIP ein neues potentielles Target zur Modulierung der T-Zellaktivierung. Unklar ist jedoch weiterhin, wie der LUBAC-Komplex zum CBM- Komplex rekrutiert wird und wie genau er zur Aktivierung von IKK und NFκB beiträgt. Die Aktivierung von NFAT-Transkriptionsfaktoren ist Voraussetzung für die meisten T-Zell-Effektorfunktionen. NFAT interagiert mit anderen Transkriptionsfaktoren. Diese Interaktionen haben großen Einfluss darauf, an welchen DNA-Sequenzen NFAT bindet und welche Wirkung diese Bindung hervorruft. So hat NFAT beispielsweise im IL-2-Promoterbereich zusammen mit AP1 einen aktivierenden und mit FOXP3 einen inhibierenden Effekt auf die IL-2-Produktion. In Abwesenheit von Interaktionspartnern ist eine Bindung von NFAT im IL-2-Promoterbereich hingegen nicht nachweisbar. Durch Kombination von Co-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie konnten wir über 100 bislang unbekannte, potentielle Interaktionspartner von NFATc1 und NFATc2 identifizieren, darunter mehr als 40 Transkriptionsfaktoren. Einige dieser Interaktionen (darunter die mit CREB1, RUNX1 und Ikaros) konnten im Laufe dieser Arbeit verifiziert werden. Zusätzlich haben wir mithilfe bioinformatischer Methoden potentielle gemeinsame Bindungsstellen dieser Transkriptionsfaktoren mit NFAT identifiziert. Hierbei zeigte sich, dass in genomischen Regionen, die von NFAT in aktivierten zytotoxischen T Zellen gebunden werden, dimere NFAT-RUNX und NFAT-CRE Bindemotive stark gehäuft auftreten. Weiterführende Experimente wie ChIP-Seq und molekulare Interaktionsstudien werden das Verständnis dafür schärfen, wie NFAT die T -Zell-Funktionen in verschiedenen T-Zelltypen moduliert, und wie andere Proteine die NFAT-Aktivität beeinflussen um die T-Zell-Aktivierung zu regulieren. Dies könnte die Entwicklung spezifischerer immun-modulierender Therapien vorantreiben.