Untersuchungen zum direkten und indirekten Nachweis des Erregers der Lyme- Borreliose beim Pferd unter qualitätssichernden Aspekten

Abstract

Die Verdachtsdiagnose Lyme-Borreliose wird beim Pferd häufig durch den Nachweis von Antikörpern gegen Borrelia (B.) burgdorferi sensu lato (s.l.) im Zusammenhang mit der in der Literatur beschriebenen Symptomatik gestellt. Ein direkter Nachweis von Borrelien aus Probenmaterial gestaltet sich durch die fehlende Standardisierung der Tests sehr schwierig. Die vorliegende Arbeit versuchte zu klären, ob die derzeitige Praxis des indirekten Erregernachweises für die Diagnosestellung Lyme-Borreliose (LB) beim Pferd geeignet ist und welche Rolle dem direkten Erregernachweis in der Routinediagnostik der LB ufällt. In der Klinik für Pferdekrankheiten, Allgemeine Chirurgie und Radiologie der Freien Universität Berlin wurden über einen Zeitraum von 10 Monaten 337 Patienten klinisch und labordiagnostisch auf LB untersucht. Die Einteilung der Probanden in Gruppe A (Pferde ohne auffällige Symptomatik im Sinne einer LB, n=195) und Gruppe B (Pferde mit LB-ähnlichen Symptomen, n=142) erfolgte im Anschluss an die vollständige klinische Untersuchung. Mit Hilfe von 2 kommerziell erhältlichen ELISA (A und B), einen im BgVV entwickelten ELISA (C) sowie einem IFT wurden alle Tiere (n=337) auf Antikörper (IgG) gegen B. burgdorferi s.l. getestet. Zusätzlich erfolgte die Gewinnung von Probenmaterial (Haut, Liquor, Synovia, Vollblut) von LB-verdächtigen Pferden, das für den direkten Erregernachweis (kulturelle Anzüchtung, PCR) zur Verfügung stand. Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der ELISA wurden im Western Blot (Labor ALOMED) hochpositive Seren der ELISA A, B, und C (je n=5), in allen Tests negative Seren (n=3) sowie die beiden Positivkontrollen der kommerziellen ELISA (A und B) untersucht. Die Positivkontrolle des ELISA C entsprach einer der hochpositiven Serumproben der ELISA. Mit Hilfe eines weiteren ELISA (LGL) erfolgte die Detektion von IgA-, IgM- und IgG-AK in Liquorproben (n=15) sowie von IgM- und IgG-AK in den dazugehörigen Seren (n=15). Die kulturelle Anzüchtung und die PCR wurden für den direkten Erregernachweis verwendet. Die Kultivierung von Haut- (n=16), Liquor- (n=15) und Synoviaproben (n=26) erfolgte in nativen sowie mit verschiedenen Hemmstoffen versetzten BSK- und MKP-Medien bei 33°C über 3 Monate. Die Kulturen wurden 1x wöchentlich subkultiviert und auf Borrelien mittels Dunkelfeldmikroskopie untersucht. In Haut- (n=14), Liquor- (n=15), Synovia- (n=26) und Vollblutproben (n=19) erfolgte der Nachweis von B. burgdorferi s.l.-DNA mit Hilfe der OspA-spezifischen nested-PCR. Zur Überprüfung der Spezifität der positiven PCR-Ergebnisse wurde vom Labor ALOMED eine PCR mit Hilfe des LightCyclers durchgeführt. Die Ergebnisse der serologischen Tests lassen eine hohe Diskrepanz innerhalb der Seroreagenten erkennen. So detektierten der ELISA A 61,1%, der ELISA B 9,8% und der ELISA C 3,3% der Pferde als seropositiv (n=337). Mit dem IFT (Grenztiter 1:128) konnten 33,2% der Seren positiv bewertet werden. Eine Übereinstimmung der serologischen Testergebnisse lag bei 74 Tieren (22,0%) vor. Davon zeigten 68 Pferde (20,2%) ein negatives und 6 (1,8%) ein positives Resultat. Ein Unterschied der Seropositivität zwischen klinisch unauffälligen (Gruppe A) und auffälligen Tieren (Gruppe B) war nicht zu erkennen. Darüber hinaus konnte kein Zusammenhang zwischen Antikörpertitern und verdächtigen LB-Symptomen beobachtet werden. Im Western Blot wurden alle positiven (n=15) und negativen (n=3) Seren bestätigt, die Positivkontrolle der zwei kommerziell erhältlichen ELISA A und B jedoch nicht. Der LGLELISA wies bei den unterschiedlichen Serumverdünnungen: (1:50 = Verdünnung ELISA A) 53,3%, (1:200 = Verdünnung ELISA C) 26,7% und (1:400 = Verdünnung ELISA B) 6,7% seropositive Reagenten auf. Eine qualitative Übereinstimmung lag mit dem ELISA A vor. Die kulturelle Anzüchtung von B. burgdorferi s.l. aus dem Probenmaterial (n=57) verlief in allen Fällen negativ. In einer Hautprobe wurden unbewegliche, spirochätenähnliche Gebilde beobachtet, bei denen es sich möglicherweise um Flagellenzöpfe der Begleitkeime handelt. Der spezifische DNA-Nachweis mit Hilfe der nested-PCR gelang in drei Haut- (3/16), zwei Liquor- (2/15), sechs Synovia- (6/26) und einer Vollblutprobe (1/19),. Die Realtime-PCR konnte keine B. burgdorferi s.l.-DNA in diesen Proben nachweisen. Eine Übereinstimmung zwischen dem Nachweis von spezifischer Borrelien-DNA und Seropositivität wurde nicht registriert. Diese widersprüchlichen Resultate implizieren die Dringlichkeit der Evaluierung direkter und indirekter Nachweisverfahren von B. burgdorferi s.l. in der Labordiagnostik. Ohne standardisierte Methodik (Antigenbeschichtung, Serumverdünnung, Positivkontrolle) der serodiagnostischen Tests sind die erforderlichen Ansprüche an die Sensitivität und Spezifität nicht erfüllt. Nur unter der Voraussetzung einer zuverlässigen Methode sind serologische Verlaufsuntersuchungen sinnvoll, die bei charakteristischer Titerdynamik und Vorliegen klinischer Zeichen auf die Verdachtsdiagnose LB hinweisen. Aufgrund der fehlenden Standardisierung der PCR und der hohen Ansprüche des Erregers an Wachstum und Milieu bei der kulturellen Anzüchtung sind direkte Nachweisverfahren für die Routinediagnostik derzeit nicht geeignet.

The clinical diagnosis of Lyme disease (LD) in horses is often established by detection of Borrelia (B.) burgdorferi sensu lato (s.l.) antibodies in conjunction with clinical symptoms as specified in literature. Because of the lacking standardization of the tests it turned out that the detection of Borrelia in the specimens was very difficult.The aim of the study was to evaluate the common practice of serological testing for the establishment of the diagnosis LD in horses. 337 patients referred to the Clinic for Horses, Surgery and Radiology of the Freie Universität Berlin were examined clinically for a period of ten month and the collected samples were tested further in the laboratory of the BgVV Berlin. The probands were classified in group A (horses independent of clinical symptoms, n=195) and group B (horses with clinical symptoms, n=142) after a full clinical examination. In the study serum samples of horses (n=337) were tested using two commercial ELISA testkits (A and B), an ELISA (C) and IFT homemade at the BgVV for B. burgdorferi s.l. antibodies (immunglobulin G). In addition, specimens of skin, liquor, synovial fluid and blood of horses with clinical symptoms were analysed by PCR and cultivation (n=76). In order to determine the sensitivity of the serological assays, both positive controls of the commercial ELISA testkits (A and B), 5 highly positive sera of each ELISA (A, B and C) and 3 sera tested negative in all of them were examined with Western blot (ALOMED, n=20). The positive control of the ELISA C consisted of a sample that was high positive in all serological tests. In a further study, 15 liquor samples were tested for B. burgdorferi s.l. antibodies (immunglobulin A, M and G) and the corresponding serum samples (n=15) for immunglobulin M and G using another ELISA (LGL). In our investigations we examined Lyme disease in horses using direct methods for detection of B. burgdorferi s.l.: culture and Polymerase Chain Reaction (PCR). For the culture of B. burgdorferi skin (n=16), liquor (n=15) and synovial fluid (n=26) were inoculated into BSK- and MKP-medium native and with different inhibitoring substances. Cultures were incubated for 3 months at 33°C, subcultivated and examinated weekly by dark-field microscopy. Skin (n=16), liquor (n=15), synovial fluid (n=26) and blood (n=19) were tested for the presence of B. burgdorferi s.l. specific DNA by OspA-specific nested PCR. In order to determine the specivity of the nested PCR the positive PCR-results were examined with Realtime PCR (ALOMED). The results of the serologic testing revealed a high discrepancy within the tested probands. Following proportions of positive antibody titers were found (n=337): ELISA A: 61,1%, B: 9,8%, C: 3,3%. In the IFT 33,2% of samples were positive (cut off 1:128). Compatibility of results of serological tests existed in 22,0% of samples (74/337), only 1,8 % of samples were positive in all tests (6/337). There was no significant difference in serological results between horses with (group B) and without (group A) clinical symptoms of LD. A correlation between symptoms and seropositivity of serum samples could not be proved. In the Western blot, positive (n=15) and negative in all ELISA (n=3) sera except the positive controls of the commercial ELISA testkits (A and B) were confirmed. The LGL- ELISA detected incidences of seropositive samples (depending on dilution of serum) as follows: 53,3% (1:50), 26,7% (1:200) and 6,7% (1:400). These results are in correspondence with ELISA A. The cultivation of B. burgdorferi was negative in all cases (n=57). In one of them we could find immobile spirochete-like forms. They are supposed to be giant whips , flagellae of the contaminant flora, which are not involved in the development of Lyme disease. In the OspA-specific nested PCR 3 skin (3/16), 2 liquor (2/15), 6 synovial fluid (6/26) and 1 blood (1/19) samples were positive for B. burgdorferi s.l.-DNA. In the Realtime PCR none of these 12 positive samples were positive for B. burgdorferi s.l.-DNA (0/12). A correlation between seropositivity of serum samples and the presence of specific DNA could not be proven. These contradictory results revealed the necessity for evaluation of current direct and serological laboratory testing for B. burgdorferi s.l. Without standardised methods (concerning antigencoating, serumdilution, positive control) for the serodiagnostical tests the demands regarding specifity and sensitivity are not met. Reliable laboratory tools are a prerequisite under which a characteristic titerdynamic in conjunction with clinical signs can leed to the presumptive diagnosis LD. Due to the lack of standardization of PCR and the complex demands on cultivation direct detection of B. burgdorferi s.l. is not a suitable method for routine diagnostic at the moment.