Isolation and characterization of DNA aptamers for zinc finger proteins

Abstract

Zinc finger (zf) transcription factors are primarily involved in human diseases including cancer. Specific molecular probes that target zinc finger transcription factors may be useful for early detection and treatment of diseases. The high affinity and specificity of aptamers selected since the early 1990s have clearly demonstrated that these molecules have great potentials to meet these challenges. This work demonstrates for the first time that high affinity DNA aptamers can be isolated successfully to recognize a single zinc finger motif. They were selected against two zinc-coordinated peptides, each of which contains a single Cys2His2-type zinc finger motif of ZFY and GLI transcription factors, in two independent SELEX experiments respectively. The ZFY-aptamers have high affinities with KDs in nanomolar range to the ZFY peptide, while the GLI-aptamers exhibit binding activities with KDs of the micromolar range to the GLI peptide. Interestingly enough they show also significant binding affinities to the ZFY peptide. The binding motifs of these aptamers were defined by primary and secondary structural analyses, as well as by truncation experiments. Moreover, studies on the binding effects of metal ion replacements show that the zinc-coordinated tetrahedral structure is critical for the interaction. Subsequently, the aptamer I(B15) was determined to bind to the ZNF593 protein containing a single zinc finger motif, which is highly similar to the ZFY peptide used in the in vitro selection. The binding affinity of the aptamer to the ZNF593 protein is comparable with that to the ZFY peptide and it exhibits clearly improved affinities when compared to the random sequences of the starting library. Finally, affinity capture assays were established using the aptamer I(B15) for recognizing zf proteins from HeLa cell extracts and several zinc finger proteins were identified from the aptamer-bound nuclear proteins by MALDI-TOF-MS. The data presented also indicate that the aptamers may recognize some structural features common to the zinc finger motifs used in this study. Consequently, these selected DNA aptamers will help to better understand the interaction of single-stranded oligonucleotides with zinc finger proteins. Finally, this thesis lays the basis for further work involving Spiegelmers or aptamers with higher affinities and biostablities to be used for the diagnosis and therapy of diseases, such as tumor diseases.

Zinkfinger(zf)-Transkriptionsfaktoren sind an einer Vielzahl von menschlichen Erkrankungen, unter anderem Krebs, beteiligt. Molekulare Wirkstoffe, die spezifisch gegen Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren wirken, könnten für die Früherkennung und Behandlung dieser Krankheiten nützlich sein. Aptamere wurden seit den frühen 1990er Jahren gegen eine Vielzahl von Zielstrukturen entwickelt und eigenen sich durch ihre hohe Affinität und Spezifität besonders zur Bewältigung dieser Aufgaben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmalig erfolgreich hochaffine DNA-Aptamere gegen ein einzelnes Zinkfingermotiv generiert. In zwei voneinander unabhängig durchgeführten SELEX-Experimenten wurden Aptamere gegen zwei Zink-koordinierte Peptide erzeugt, wobei beide Peptide ein einzelnes Cys2His2-Typ Zinkfingermotiv der ZFY- und GLI- Transkriptionsfaktoren enthielten. Die ZFY-bindenden Aptamere weisen Dissoziationskonstanten im nanomolaren Bereich auf, während die gegen GLI selektierten Aptamere eine Bindung im mikromolaren Bereich zeigen und auch das ZFY Motiv binden. Mögliche Bindungsmotive der Aptamere wurden sowohl durch Primär- und Sekundärstrukturanalysen, als auch durch Verkürzungsstudien bestimmt. Aus den experimentellen Daten geht weiterhin hervor, dass die Zink- Koordinierten, tetraedrische Strukturen essentiell für die Interaktion sind. Es konnte gezeigt werden, dass das Aptamer I(B15) an das ZNF593-Protein bindet, welches ein dem ZFY ähnliches Zinkfingermotiv enthält. I(B15) hat zu ZNF593 eine vergleichbare Affinität wie zu ZFY und eine deutlich erhöhte Affinität im Vergleich zu den Zufallssequenzen der Ausgangsbibliothek. Ferner wurde ein Verfahren etabliert, bei dem unter Verwendung von dem Aptamer I(B15) zf-Proteine aus HeLa-Zellextrakten isoliert und anschließend durch MALDI-TOF- MS identifiziert werden konnten. Diese Analyse lässt den Schluss zu, dass das Aptamer gemeinsame Strukturelemente der Zinkfingermotive erkennt. Durch diese Arbeit geben die hier entwickelten Aptamere ein Werkzeug, um ein besseres Verständnis über Wechselwirkungen von einzelsträngigen Oligonukleotiden mit Zinkfingerproteinen zu erlangen. Darüber hinaus können auf Basis dieser Arbeit Spiegelmere oder Aptamere gegen Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren mit höherer Affinität und Biostabilität entwickelt werden. Diese würden in der Medizin von hohem Nutzen für diagnostische und therapeutische Anwendung sein.