Agonismus synthetischer Glukokortikoide am Gluko- und am Mineralokortikoidrezeptor des Menschen in einem CV-1-Zellsystem

Abstract

Synthetische Glukokortikoide werden seit über fünfzig Jahren zur Suppression unerwünschter Immunreaktionen eingesetzt. Ihre biologischen Wirkungen beruhen vor allem auf einer Beeinflussung der Expression verschiedener Gene unter Vermittlung des Gluko- (GR) und des Mineralokortikoid-Rezeptors (MR), die als ligandenabhängige Transkriptionsfaktoren agieren. Die gluko- und die mineralokortikoide Potenz eines GR-Agonisten werden von pharmakokinetischen Faktoren ebenso beeinflußt wie von der Intensität und Halbwertszeit der Rezeptorbindung und dem Ausmaß der durch sie induzierten Transaktivierung oder Transrepression. Letzteres läßt sich jedoch nicht allein aus Rezeptorbindungsdaten vorhersagen. Während die Wirkungen unterschiedlicher Cortisolderivate in vivo gut dokumentiert sind, liegen über ihre Potenz zur Aktivierung von GR und MR an sich nur wenige systematische Untersuchungen vor. Ziel dieser Arbeit war es daher, klinisch relevante Glukokortikoide im Hinblick auf die Transaktivierung über GR und MR in einem einheitlichen Zellkulturmodell zu vergleichen und zu untersuchen, inwieweit hierbei Parallelen zur Potenz und zur Wirkungsselektivität in vivo bestehen, und ob der Einfluß bestimmter funktioneller Gruppen auch auf der Transaktivierungsebene nachvollziehbar ist. Als Testsystem dienten CV-1-Zellen (Fibroblasten aus Affennieren), die mit folgenden Plasmiden transient transfiziert wurden: 1. Expressionsvektor für humanen GR oder MR, 2. Reporterkonstrukt mit unter Kontrolle hormonresponsiver Elemente exprimiertem Gen für die Glühwürmchen-Luciferase, 3. Vektor für konstitutive Expression einer weiteren Luciferase als interne Kontrolle. Als Maß für die Transaktivierung diente der Quotient aus beiden Enzymaktivitäten nach 24stündiger Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen des Steroids. Zum Ausschluß einer relevanten Inaktivierung von Glukokortikoiden durch die CV-1-Zellen wurde die Aktivität der 11beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 2 unter Assaybedingungen bestimmt. Es zeigte sich eine unerwartet enge Übereinstimmung der bekannten gluko- und mineralokortikoiden Potenzen in vivo mit der korrespondierenden Größe in vitro, dem Kehrwert der Steroidkonzentration bei halbmaximaler Transaktivierung (1/EC50). Die Auswirkungen struktureller Modifikationen des Cortisolmoleküls auf die Transaktivierungsfähigkeit divergieren bei beiden Rezeptoren, wodurch das Derivat eine von der Auswirkung der 11beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen unabhängige Selektivität für den Gluko- oder den Mineralokortikoid-Rezeptor aufweist. Die Bedeutung einiger funktioneller Gruppen konnte hierbei erstmals in vitro quantifiziert werden.

BACKGROUND: Synthetic glucocorticoids have been used for more than fifty years to suppress undesired immune reactions. Their biological effects are mainly the result of a differential influence on the expression of various genes, mediated by the glucocorticoid (GR) and the mineralocorticoid receptor (MR) that act as ligand-dependent transcription factors. The gluco- and the mineralocorticoid potencies of GR agonists are determined by their pharmacokinetical properties, by the intensity and half-life time of receptor binding, and by the magnitude of transactivation or transrepression the latter induces. However, the impact on transcription cannot be predicted quantitatively from receptor binding data alone. PURPOSE: While the effects of different cortisol derivatives in vivo are well documented, few reliable data on their ability of activating the GR and the MR as such are available. Therefore, the present study aimed at comparing clinically relevant glucocorticoids with regard to transactivation via GR and MR in a uniform cell culture model in order (a) to quantify the relationship between their pharmacodynamical properties and their potency and selectivity in vivo and (b) to characterize the influence of certain functional groups at the transcriptional level. METHODS: CV-1 cells (fibroblasts from green monkey kidneys) were used as a test system after transient transfection with the following plasmids: (1) expression vector for human GR or MR, (2) reporter plasmid containing the gene for firefly luciferase under control of hormone response elements, (3) plasmid for constitutive expression of Renilla luciferase serving as internal control. The quotient of both luciferase activities was used to measure transactivation after a 24 h incubation period with different steroid concentrations. 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 activity was determined under transactivation assay conditions to rule out a relevant enzymatic inactivation of glucocorticoids in the CV-1 cells. RESULTS: The known gluco- and mineralocorticoid potencies in vivo correlated unexpectedly close with their corresponding parameters in vitro, the reciprocals of the steroid concentrations needed for half-maximal transactivation (1/EC50). Structural modifications of the cortisol molecule changed the ability of transactivation via GR or MR, but not to the same extent for both receptors. Thus, synthetic corticoids can possess a higher selectivity than cortisol for either the gluco- or the mineralocorticoid receptor, independent of the action of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenases. Regarding this aspect, the effect of several functional groups could be characterized for the first time in vitro.