The Lewis Y antigen: Recognition and Mimicry

Abstract

The goal of my work was to enhance the knowledge on Lewis Y binding antibodies and their interaction with the antigen for the development of Lewis Y-specific therapeutics using advanced antibody technologies including anti-idiotypic antibodies. The Lewis Y carbohydrate antigen is overexpressed in 60-90% of cancers of epithelial origin, which makes it a target of interest for therapy. Immunotherapeutics are promising candidates for future clinical applications. Several antibodies have been developed against Lewis Y, but most of them cross-react with related carbohydrate structures. The specificity determination of the four Nemod Lewis Y binding antibodies showed that one (A70-C/C8) bound exclusively to the Lewis Y antigen, whereas the three others revealed cross-reactivities to related carbohydrate structures. A chimeric mouse-human IgG was successfully generated from the IgM antibody A70-C/C8 and this chimeric antibody (cIgG CC8) proved to be as specific towards Lewis Y, as the parent antibody. Starting from two mouse monoclonal antibodies two new chimeric antibodies were created by rearrangement of their chains. As a result new chimeric antibodies (AA9/CC8) were generated as IgM as well as IgG. These new antibodies were found to have two important features: (1) Exclusive recognition of Lewis Y and (2) enhanced reactivity to Lewis Y. Approximately a factor of 10 was estimated for the cIgG AA9/CC8 when compared to the cIgG CC8. The antibodies were evaluated in ELISA, flow cytometry, immunocytology, and surface plasmon resonance. The data generated show that the antibody cIgG AA9/CC8 is the most promising candidate for further development and optimising. A thorough investigation of the antigens recognised by the Nemod antibody A70-A/A9 revealed two related carbohydrate structures, Lewis Y and Lewis b, and surprisingly the histone H1. This is the first real hint to a naturally occurring immunological mimicry between carbohydrate structures and a naturally occurring protein. Anti-histone antibodies are often found in patients suffering from the auto-immune disease systemic lupus erythematosus (SLE). The mimicry identified here suggests a possible explanation for the cross-reaction of some SLE auto-antibodies to the surface of cancer cells. Generally carbohydrates are weak immunogens whereas it is possible to generate a strong anti-carbohydrate response by vaccination with protein mimics, e.g. anti-idiotypic antibodies. Anti-idiotypic antibodies have so far been generated by a tedious process involving immunising mice and generation of hybridomas. We developed an improved phage display selection strategy that after only a few rounds of selection generated clones with the wanted specificity from naïve scFv-phage libraries. Only two rounds of selection using specific elution with the antigen and a protolytic helper phage ensured that maximum diversity was retained in the selected clones. It could be also shown that an anti-idiotypic scFv generated with this new technique was able to induce an anti-carbohydrate response in mice. This technique is promising as a new tool for the selection of anti-idiotypic antibodies and surrogate molecules. Furthermore, it could be demonstrated that the fusion of DI of the phage protein p3 to the scFvs, previously shown to be a mediator of activity, also provides good adjuvant properties and is a new method for inducing immunogenic responses. Results of basic research presented here enhance the knowledge for the development of tailored immunotherapeutics.

Immuntherapeutika gewinnen in der Krebstherapie an Bedeutung. Das Kohlenhydrat-Antigen Lewis Y (LeY) ist ein lohnendes Zielantigen, da es in 60-90 % der Tumoren epithelialer Herkunft überexprimiert ist. Eine Anzahl von Antikörpern gegen dieses Antigen wurde bereits beschrieben, aber die meisten von diesen zeigen Kreuzreaktionen mit verwandten Kohlenhydrat-Strukturen, die auch auf gesunden Geweben vorkommen. Das Ziel meiner Arbeit waren die detaillierte Spezifitätsanalyse von vier Lewis Y-bindenden Antikörpern (mAk) der Firma Nemod (darunter drei noch nicht beschriebenen), die Charakterisierung ihrer Interaktion mit dem Epitop sowie die Generierung von rekombinanten Antikörpern und antiidiotypischen Antikörpern als potentiellen Immuntherapeutika. Die Spezifitätsanalyse der vier mAk ergab, dass ein Antikörper (A70-C/C8, IgM) absolut spezifisch für Lewis Y ist, während die drei anderen unterschiedliche Kreuzreaktivitäten zu verwandten Kohlenhydrat- Strukturen aufweisen. Aus A70-C/C8 wurde ein chimärer Human/Maus-Antikörper als IgG mit gleicher Spezifität generiert (cIgG CC8). Weiterhin wurden chimäre Human-Maus-Antikörper (IgM und IgG) mit unterschiedlichen leichten Ketten (AA9/CC8) hergestellt und umfassend charakterisiert. Diese Antikörper haben sehr interessante Eigenschaften: 1. Sie reagieren ausschließlich mit LeY (wie CC8). 2. Sie zeigen eine etwa 10fach stärkere Bindung an das Antigen im Vergleich zu cIgG CC8. Die IgG-Variante ist ein vielversprechender Ausgangspunkt für die Entwicklung eines therapeutischen Antikörpers. Die Spezifitätsanalyse des Antikörpers A70-A/A9 ergab Bindung an zwei verwandte Kohlenhydrat-Strukturen, Le Y und Le b, sowie überraschend an ein Protein, Histon H1. Die Daten werden interpretiert als Erstbefund einer immunologischen Mimikry zwischen natürlich vorkommenden Oligosaccharid- und Peptid-Antigenen. Anti-Histon-Antikörper werden häufig bei Patienten mit systemischer Lupus erythematosus-Erkrankung (SLE) gefunden. Gleichzeitig reagieren SLE- Autoantikörper häufig mit Tumorzellen. Da Kohlenhydrate oft schwache Immunogene sind, eignen sie sich nicht immer für Vakzinen. Eine Möglichkeit, bessere Immunogenität zu erreichen, sind anti-idiotypische Antikörper, die das ursprüngliche Antigen immunologisch imitieren. Diese Strategie wurde mit der Generierung anti-idiotypischer single-chain-Antikörper (scFv) im Fall des Le Y-Tumorantigens angewendet. Zu diesem Zweck wurde eine verbesserte Methode zur Phagen-Display-Selektion entwickelt, die es erlaubt, nach wenigen Selektionsrunden eine hohe Ausbeute und große Vielfalt von Klonen der gewünschten Spezifität zu erhalten. Die neue Methode kombiniert die Verwendung eines Trypsin-empfindlichen Helferphagen mit antigen-spezifischer Selektion. Mit ihr konnten scFvs selektiert werden, die das Lewis Y-Antigen immunologisch imitieren und in vivo in Mäusen Antikörper gegen Le Y generieren. Weiterhin wurde durch Fusion von DI des Phagen p3 an die scFv ein sehr guter Adjuvans- Effekt erzeugt werden. Diese methodischen Neuerungen sind wichtige Voraussetzungen für weitere Arbeiten zur Herstellung massgeschneiderter Immuntherapeutika.