Heterologe Expression und strukturelle Charakterisierung der intrazellulären Domäne der delta-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors

Abstract

In dieser Arbeit wurde die intrazelluläre Domäne der δ-Untereinheit des nikotinischen Acetylcholinrezeptors von Torpedo californica und Rattus norvegicus kloniert, exprimiert, gereinigt und strukturell charakterisiert. Als geeignetes Expressionssystem wurde Escherichia coli gewählt. Die Expression in eukaryotischen Zellen konnte auf Grund der Toxizität des untersuchten Proteins nicht in größeren Mengen erfolgen. Die intrazelluläre Domäne des nAChR wurde in Form unterschiedlicher Fusionsproteine untersucht. Als Strep-Fusionsprotein wurde nur eine unlösliche, geringe Expression erreicht, eine nachfolgende Anreicherung war nicht möglich. Dagegen konnte das Hexahistidin-Fusionsprotein der intrazellulären Domäne des nAChR in großer Menge exprimiert werden. Dies wurde jedoch ausschließlich in inclusion bodies erreicht. Durch Reinigung unter denaturierenden Bedingungen konnte reines Protein (auf SDS-Page, Coomassie gefärbt) isoliert werden. Allerdings sollte ein Protokoll für die Isolierung der intrazellulären Domäne des nAChR unter nicht-denaturierenden Bedingungen entwickelt werden, da für die Aktivität der Domäne kein biochemischer Test zur Verfügung steht und es so am wahrscheinlichsten ist, die Domäne in ihrer nativen Form zu erhalten. So wurden Fusionsproteine generiert, die die Löslichkeit des untersuchten Proteins verbessern. Eine lösliche Expression und die Reinigung unter nativen Bedingungen als GST- und MBP-Fusionsprotein konnte erreicht werden. Allerdings erwiesen sich diese Fusionsproteine als besonders instabil, was sich durch die Anwesenheit mehrerer Degradationsprodukte zeigte. Eine nachfolgende Abspaltung des Fusionspartners mit verschiedenen Aminosäuresequenz-spezifischen Proteasen (Faktor Xa, Enterokinase, Genenase I) war möglich, führte jedoch auch zu einem Abbau der intrazellulären Domäne des nAChR. Alternativ wurden Intein- und SUMO-Fusionsproteine löslich exprimiert. Für die Isolierung der intrazellulären Domäne des nAChR vom Intein-Fusionsprotein war ein internes Proteinsplicing notwendig, das allerdings für die untersuchten Proteine nicht erreicht werden konnte. Das SUMO-Fusionsprotein konnte unter nativen Bedingungen gereinigt werden. Eine nachfolgende Abspaltung des Fusionspartners mit der Tertiärstruktur-erkennenden SUMO-Protease war ebenfalls erfolgreich. Eine Isolierung der intrazellulären Domäne des nAChR von den unverdauten SUMO- Fusionsproteinen für eine weitere Charakterisierung konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erreicht werden, eine Stabilisierung durch Detergenzien erwies sich als notwendig. Da eine Anreicherung der intrazellulären Domäne des nAChR unter nativen Bedingungen nicht erfolgreich war, erfolgte die Rückfaltung der aus inclusion bodies gewonnenen Hexahistidin-Fusionsproteine. Für das Fusionsprotein aus Torpedo war eine Renaturierung durch Gelfiltration und Dialyse erfolgreich. Es konnte eine Probe mit 0,3 mg/ml Fusionsprotein erhalten werden, die für eine nachfolgende strukturelle Charakterisierung zur Verfügung stand. Die Renaturierung für das Hexahistidin-Fusionsprotein der intrazellulären Domäne des nAChR aus Ratte war nur erfolgreich in Gegenwart der Detergenzien Dodecylmaltosid und Dodecylphosphocholin. Eine Charakterisierung mittels CD-Spektroskopie ergab einen hohen Anteil ungeordneter Konformation im untersuchten Protein. Diese Annahme wurde durch Experimente mit limitierter Proteolyse unterstützt, wo keine Fragmente, die auf kompakte Strukturen hinweisen, identifiziert wurden. Da in Gegenwart von Dodecylphosphocholin eine Konzentration der Hexahistidin-Fusionsproteine von 6 mg/ml erreicht wurde, erfolgte hier eine NMR-spektroskopische Untersuchung. Die Aufnahme eines 15N-HSQC Spektrums bestätigte die Beobachtung, dass die untersuchten Proteine vorwiegend unstrukturiert vorliegen. Mit analytischer Ultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem untersuchten Protein in diesen Experimenten um ein Monomer im Komplex mit Dodecylphosphocholin handelt. Der Einfluss posttranslationaler Modifikationen auf die Sekundärstruktur der intrazellulären Domäne des nAChR wurde durch Variationen der Konstrukte untersucht. Die Einführung einer Phosphorylierung bzw. die Imitation einer Serinphosphorylierung durch eine Serin-Aspartat- Mutation zeigten keinen Einfluss auf die Sekundärstruktur. Auch die Veränderung des N- und C-Terminus der intrazellulären Domäne des nAChR bezüglich ihrer Länge zeigte keinen Effekt auf die Faltung des untersuchten Proteins. Sekundärstrukturvorhersagen ergeben für die intrazelluläre Domäne des nAChR einen hohen Anteil ungeordneter Konformation. Vermutlich führt erst eine Bindung von Interaktionspartnern zur Induzierung einer Sekundärstruktur. Dies konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht detaillierter untersucht werden.

Here I present the cloning, expression, purification and structural characterization of the intracellular domain of the δ-subunit of the nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica and Rattus norvegicus. Escherichia coli was chosen as an appropriate expression system. The expression in eukaryotic cells was too low for further investigations due to the toxicity of the investigated protein. First the expression and purification of the intracellular domain of the nAChR was optimized using different fusion proteins. The expression of Strep-fusion proteins resulted in low amounts insoluble protein. In contrast, the hexahistidin-fusion protein of the intracellular domain of the nAChR was expressed in high amounts. Although the hexahistidin-fusion proteins were insoluble performing purification under denaturating conditions, pure protein (indeed from Coomassie stained SDS-PAGE) could be obtained in one step. While no biochemical test for the activity of the investigated domain is available right now, the purification protocol should be established under non-denaturating conditions. Therefore different fusion proteins were generated to enhance the solubility of the investigated protein. The expression as a soluble protein and purification under native conditions could be obtained using GST- and MBP-fusions. Unfortunately, the resulting fusion proteins turned out to be instable and multiple degradation products could be observed. Cleavage of the fusion partner with different aminoacid-sequence-specific proteases (factor Xa, enterokinase, genenase I) resulted in enhanced degradation of the intracellular domain of the nAChR. As an alternative approach, Intein- and SUMO-fusion proteins were expressed. Both fusions resulted in soluble protein. However, isolation of the intracellular domain of the nAChR by an Intein-mediated internal protein splicing mechanism could not be reached. The SUMO-fusion protein could be purified under native conditions. The removal of the fusion partner with the tertiary-structure recognizing SUMO-protease was successful. However, isolation of the intracellular domain of the nAChR from the uncleaved construct could not be reached due to the instability of the domain in the absence of detergents. As enrichment of the intracellular domain of the nAChR was not successful under native conditions, the hexahistidin-fusion proteins had to be purified from inclusion bodies and refolded. The fusion protein from Torpedo could be renaturated by gelfiltration or dialysis. A sample of 0.3 mg/ml fusion protein was available for structural characterization. The renaturation of the intracellular domain of the nAChR from rat was only successful in the presence of the detergents dodecylmaltoside and dodecylphosphocholine. A characterization with CD spectroscopy revealed a high portion of disordered conformation of the investigated protein. This conformation was further proven by experiments with limited proteolysis, since no fragments with compact structures could be formed. In the presence of dodecylphosphocholine the hexahistidin-fusion proteins could be concentrated to 6 mg/ml enabling NMR- spectroscopic investigations. The record of a 15N-HSQC-Spektrum confirmed the unstructured confirmation of the investigated proteins. Analytical ultracentrifugation showed that the intracellular domain of the nAChR is a monomer in association with dodecylphosphocholine. An influence on the secondary structure of the intracellular domain of the nAChR was investigated with variations of the construct. The introduction of a phosphorylation or mimicking the serine-phosphorylation by a serine-aspartate-mutation did not show an effect on the secondary structure. A change in the length of the N- or C-Terminus of the intracellular domain of the nAChR had also no influence on the structure of the investigated protein. In agreement with the experimental findings, also secondary-structure predictions anticipate a high content of disordered conformation for the intracellular domain of the nAChR. I suggest that a binding of an interaction partner induced an ordered secondary structure. This hypothesis could not be investigated in more detail in the presented work.