Molecular characterization of cellular subgroups in the caudal end of the mouse embryo

Abstract

The caudal end of the midgestational mouse embryo comprises several important subdomains which are essential for morphogenesis and tissue maintenance during trunk and tail elongation. This study investigates different cellular subdomains from the caudal ends of 9.0 and 10.5 days post coitum (dpc) murine embryos. Each of these subgroups is characterized by the specific expression of a different marker gene. Four different marker genes were chosen for this study: Tlx2, Mixl1, Sct and Pax3. Lineage tracing was performed to reveal the progeny of each subgroup. In order to compare the localization of subgroup descendants at these two distinct time-points during embryonic development, an inducible construct was employed. Two different reporter genes were genetically integrated into ES cells for the generation of reporter embryos. For lineage tracing analysis, a lacZ gene was integrated in the ROSA26R locus, able to be triggered by tamoxifen induction. For RNA-Seq analysis, a Venus fluorescent protein under control of the marker gene promotor was used for cell sorting. The lineage tracing assay revealed Mixl1 expressing cells in lateral and paraxial mesoderm, and in the posterior notochord. Tlx2 expressing progeny were found in the hindgut, and progeny of Sct expressing cells were spotted throughout the mesoderm. Descendants of Pax3 expressing cells were located in the neural tube and later in ganglion structures. The transcriptomes of each cellular subgroup were examined using RNA-Seq. Data from the lineage tracing approach was integrated in order to find upregulated genes for directed processes within each subgroup of sorted cells. Transcriptome analysis of the Mixl1 subgroup indicated upregulation of Noto, which is involved in notochord development. Additionally, genes involved in processes characteristic for mesoderm were found. Thus Mixl1 expressing cells could contain two different subgroups or could be precursors for different domains of mesoderm. Since progeny of Tlx2 expressing cells were found in the hindgut, genes indicating participation in endoderm development were examined and genes coding for integral membrane proteins were identified. My observation that progeny from Tlx2 expressing cells contribute to hindgut development has not been described before. Previous research detailed hindgut formation as a process expanding in a rostral-to-caudal direction. Here I depict the novel finding that a second origin for the hindgut exists, derived from cells from the caudal end. For the subdomain of Pax3 expressing cells, neural crest cell genes were found to be upregulated. This novel finding shows that neural crest cells arise from the mesodermal Pax3 expressing region in the caudal end to contribute to NC development. Transcriptome analysis of cells sorted for Sct expression identifies this subdomain as a component of the mesoderm, without any additional functional distinctions. Overall, the work contained in this thesis uses an innovative genetic approach to provide functional information about various cellular subpopulations within the developing mouse caudal end. Presented results confirm not only common correlations but give novel insights into so far unknown processes of embryonic mouse development.

Das kaudale Ende des 9.0 Tage alten Mausembryos besteht aus unterschiedlichen Teilbereichen, welche wichtige Funktionen während der Rumpf- und Schwanzentwicklung inne haben. In dieser Arbeit wurden mehrere Untergruppen des kaudalen Endes von 9 und 10 Tage alten Mausembryonen untersucht. Jede dieser Untergruppen ist durch die spezifische Expression eines Gens charakterisiert. Für diese Arbeit wurden 4 unterschiedliche Markergene, Mixl1, Tlx2, Sct und Pax3 augewählt. Eine Zellstammbaumanalyse, bei welcher eine per Tamoxifen induzierbare Kassette verwendet wurde, ermöglichte Untersuchungen zu ausgewählten Zeitpunkten während der Embryonalentwicklung. Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche Reportergene verwendet. Das Venusreportergen, welches vom Promotor des Markergens kontrolliert wurde, sowie ein lacZ-Gen. Das lacZ-Gen, war in den ROSA26R Genlokus integriert und wurde somit nur nach erfolgter Applikation von Tamoxifen durch Rekombinase vermitteltes Ausschneiden einer Stoppkassette exprimiert. Venus exprimierende Zellen wurden zusätzlich mittels fluoreszenzbasierter Durchflusszytometrie sortiert und anschließend für RNA-Sequenzierung verwendet. Die Zellstammbaumanalyse zeigte die Lokalisation der Tochterzellen der unterschiedlichen durch die Markergene charakterisierten Subdomänen. Im lateralen und paraxialen Mesoderm, sowie im Notochord fanden sich Abkömmlinge der Mixl1 exprimierenden Zellen. Tochterzellen von Tlx2 exprimierenden Zellen wurden im Hinterdarm nachgewiesen. Nachkommen von Sct exprimierenden Zellen wurden verstreut im Mesoderm identifiziert. Nachfahren von Pax3 exprimierenden Zellen wurden im Neuralrohr, sowie zu einem späteren Zeitpunkt der Embryonalentwicklung in Nervenknoten gefunden. Die Transkriptomanalyse von sortierten Zellen mit Mixl1 Expression zeigte das Gen Noto in diesen Zellen erhöht exprimiert. Außerdem waren verstärkt exprimierte Gene enthalten, welche in Entwicklungsprozesse involviert sind, die charakteristisch für das Mesoderm sind. Folglich könnten die Mixl1 exprimierenden Zellen aus zwei unterschiedlichen Untergruppen zusammengesetzt sein, oder Vorläufer unterschiedlicher Mesodermdomänen enthalten. Nachkommen Tlx2 exprimierender Zellen wurden im Hinterdarm gefunden. In der Transkriptomanalysi konnten Gene die zu Entwicklung des Endeoderms beitragen und insbesondere für transmembrane Proteine kodierende Gene identifiziert werden. Das Zellen, insbesondere Tlx2 exprimierende Zellen aus dem kaudalen Ende des Mausembryos zur Entwicklung des Hinterdarmes beitragen, ist bisher noch nicht beschrieben worden. Nach bisheriger Auffassung wächst der Hinterdarm vom anterioren in Richtung des Kaudalen Endes. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass es zwei Richtungen gibt aus denen Zellen zur Hinterdarmentwicklung beitragen. Bei Zellen aus der Subregion des kaudalen Endes mit Pax3 Expression konnte gezeigt werden, dass diese Zellen Gene exprimieren, die in die Entwicklung von Neuralleistenzellen involviert sind. Diese neuen Ergebnisse zeigen, dass sich auch aus der mesodermalen Expressionsdomäne von Pax3 Neuralleistenzellen heranbilden. Die Analyse des Transcriptomes von Sct exprimierenden Zellen wies diese Domäne als Teil des Mesoderm, aber ohne eine für diese Domäne besondere Funktion aus. In der vorliegenden Forschungsarbeit wurde ein innovativer Ansatz gewählt, um neue Erkenntnisse über funktionelle Zusammenhänge in zellulären Subpopulationen des kaudalen Endes der Maus zu gewinnen. Die hier vorgelegten Ergebnisse untermauern einerseits bestehende Erkenntnisse, zeigen aber vor allem bisher unbekannte, neue Zusammenhänge der Embryonalentwicklung der Maus auf.