Improvement of the Sleeping Beauty transposon system

Abstract

Sleeping Beauty (SB) is the most active Tc1/mariner-type transposon in vertebrates. It is a synthetic transposable element that has been reconstructed from defective copies of an ancestral Tc1-like element in fish (Ivics at al., 1997). It is a 1.6-kb element that is flanked by ~230-bp terminal inverted repeats (IRs), and encodes a single protein, the transposase, that catalyzes transposition of the element from one genomic locus to another. SB transposes by a cut-and-paste mechanism that requires binding of the transposase to its binding sites within the IRs. Each IR contains two transposase-binding sites (DRs), a feature termed the IR/DR structure. SB shows high transpositional activity in a number of vertebrate cell lines in vitro (Izsvak et al., 2000), and in both somatic and germline tissues of the mouse in vivo (Yant et al., 2000; Dupuy et al., 2002). Thus, SB is being developed as a gene vector for transgenesis and insertional mutagenesis in vertebrate model systems as well as for human gene therapy. However, biological evidences indicate that the maximal activity of the SB transposon system has not yet been reached. To improve the transpositional activity of the SB transposable element, I followed three experimental approaches: 1) find the optimum conditions under which SB can transpose, by investigating the role of host factors which may directly or indirectly be involved in SB transposition; 2) increase the recombinational activity of the SB transposase; 3) modify the structure of the SB transposon DNA. Most transposons do not function (well) without accessory (host) factors (Sherrat, 1995). The involvement of cellular proteins in the regulation of SB transposition was investigated in this thesis. I show that the DNA-bending high-mobility group protein, HMGB1, is a host-encoded cofactor of SB transposition. Transposition was severely reduced in mouse cells deficient in HMGB1. This effect was rescued by transient over-expression of HMGB1, and was partially complemented by the closely related HMGB2, but not with the unrelated HMGA1 protein. Over-expression of HMGB1 in wild-type mouse cells enhanced transposition, indicating that HMGB1 can be a limiting factor of transposition. SB transposase was found to interact with HMGB1 in vivo, suggesting that the transposase may recruit HMGB1 to transposon DNA. HMGB1 stimulated preferential binding of the transposase to the DR further from the cleavage site, and promoted bending of DNA fragments containing the transposon IR. The role of HMGB1 is proposed to ensure that transposase-transposon complexes are first formed at the internal DRs, and to subsequently promote juxtaposition of functional sites in transposon DNA, thereby assisting the formation of synaptic complexes. Transposases are not selected for maximal activity in nature, because high transpositional activity may be detrimental to the host. Indeed, replacements of some of the acidic (negatively charged) amino acids to basic (positively charged) amino acids in both the bacterial transposase Tn5 (Zhou and Reznikoff, 1997) and the mariner element Himar1 transposase (Lampe et al., 1999) were found to elevate the recombinational activities of the transposases. Similar, we hypothesized that the intrinsic activity of the SB transposase can be increased by amino acid substitutions. Following the lessons of Tn5 and Himar1 mutagenesis, I systematically replaced all aspartic acid (D) and glutamic acid (E) residues (that are not conserved within the Tc1 family) of the SB transposase with lysine (K) or arginine (R) residues. One such mutant, D260K, consistently increased the jumping efficiency of SB with about 30%. D260K works synergistically with other hyperactive mutations to elevate the overall transposition efficiency to about 370% over the wild-type SB transposase. The success of this limited range of site-directed mutagenesis indicates that large-scale, random mutagenesis of the SB transposase will likely yield hyperactive versions with as high as possibly a 100-fold increase in activity. The other component of the transposon system where modifications might improve activity is the transposon DNA. Indeed, a combination of four mutations in the IRs was shown to increase the activity of the SB transposon by about 4-fold (Cui et al., 2002). The efficiency of SB transposition decreases with increasing the transposon size (Izsvak et al., 2000). We reasoned that changing the structure of the transposon could increase its ability to mobilize longer DNA fragments. For example, a composite transposon consisting of two identical copies of itself flanking a nonrepetitive sequence (longer than 10kb) in an inverted orientation has been seen to be mobilized in the fly species Drosophila virilis (Petrov et al., 1995). This transposon is called the Paris element (Petrov et al., 1995). TA target site dinucleotide duplications flanking the particular composite Paris transposon (Petrov et al., 1995) indicate that the insertion was generated by transposition. A construct mimicking the structure of the composite Paris element was made from two identical copies of the SB transposon flanking relatively large pieces of DNA in an inverted orientation. The inner binding sites of the transposase were mutated to ensure that the individual SB units cannot transpose. These mutations were proven to only interfere with the transposition capacity but not with the binding capability of the transposase. This construct is called the sandwich vector (SA). SA was able to jump 3 times more efficiently than similar size marker genes.

Sleeping Beauty (SB) ist das aktivste Transposon des Tc1/mariner-Typs in Vertebraten. Es ist ein synthetisches transposables Element, das aus defekten Kopien eines Tc1-ähnlichen Vorgänger-Elements aus Fischen rekonstruiert wurde (Ivics at al., 1997). Es ist ein 1,6 kb-Element, das von ~230 bp endständig invertierten Wiederholungen (terminal inverted repeats, IRs) flankiert wird und ein einzelnes Protein kodiert, die Transposase, die die Transposition des Elements von einem Gen-Locus zum anderen katalysiert. SB transposiert durch einen Ausschneiden-und-Einfügen-Mechanismus, der die Bindung der Transposase an ihre Bindungsstellen in den IRs erfordert. Jedes IR enthält zwei Transposase-Bindungsstellen (DRs), ein Charakteristikum, das als IR/ID- Struktur bezeichnet wird. SB besitzt hohe Transpositions-Aktivität in einer Anzahl von Vertebraten-Zelllinien in vitro (Izsvak et al., 2000), und sowohl in somatischen als auch in Keimbahn-Geweben der Maus in vivo (Yant et al., 2000; Dupuy et al., 2002). Folglich wird SB als ein Gen-Vektor für Transgenese und insertielle Mutagenese in Vertebraten-Modellsystemen ebenso wie für humane Gentheapie entwickelt. Jedoch weisen biologische Anhaltspunkte darauf hin, daß die maximale Aktivität des SB-Transposon-Systems noch nicht erreicht wurde. Um die transposale Aktivität des SB Transposablen Elements zu verbessen, verfolgte ich drei experimentellen Ansätze: 1) Finde die optimalen Bedingungen, unter denen SB transposieren kann, in dem die Rolle von Wirtsfaktoren untersucht wird, die direkt oder indirekt an der SB Transopisition beteiligt sind; 2) erhöhe die rekombinatorische Aktivität der SB Transposase; 3) modifiziere die DNA-Struktur des SB Transposons. Die meisten Transposons funktionieren nicht (gut) ohne zusätzliche (Wirts)faktoren (Sherrat, 1995). Die Beteiligung von zellulären Proteinen an der Regulation der SB Transposition wurde in dieser Doktorarbeit untersucht. Ich zeige, daß das DNA-biegende high-mobility group Protein 1 (HMGB1) ein Wirts-kodierter Cofaktor der SB Transposition ist. In Mauszellen, denen HMGB1 fehlte, war die Transposition stark reduziert. Dieser Effekt konnte durch transiente Überexpression von HMGB1 verhindert werden und wurde durch das eng verwandte Protein HMGB2, nicht aber durch das keine Verwandschaft zeigende HMGA1-Protein teilweise ausgeglichen. Überexpression von HMGB1 in Wildtyp-Mauszellen verstärkte die Transposition, was darauf hinweist, daß HMGB1 ein limitierender Fakter der Transposition sein kann. SB Transposase interagiert mit HMGB1 in vivo, so daß vermutet werden kann, daß die Transposase HMGB1 an die Transposon-DNA rekrutiert. HMGB1 stimulierte die Bindung der Transposase an der von der Schnittstelle weiter entfernte DR, und förderte die Biegung von DNA-Fragmenten, die das Transposon-IR enthielten. Die für HMGB1 vorgeschlagene Rolle ist es, sicherzustellen, daß Transposase-Transposon-Komplexe zuerst an der internen DR formiert werden und anschließend die Nebeneinanderstellung von funktionalen Stellen in der Transposon-DNA zu fördern, wodurch die Bildung von synaptischen Komplexen unterstützt wird. Transposasen werden in der Natur nicht auf höchste Aktivität selektiert, weil hohe transpositionale Aktivität schädlich für den Wirt sein kann. Tatsächlich wurde gefunden, daß Ersetzen einiger saurer (negativ geladener) Aminosäuren durch basische (positiv geladene) Aminosäuren sowohl in der bakteriellen Transposase Tn5 (Zhou and Reznikoff, 1997) als auch im mariner Element Himar1 Transposase (Lampe et al., 1999) die rekombinatorische Aktivitöt der Transposasen erhöht. Deshalb vermuteten wir, daß die intrinsische Aktivität der SB Transposase durch Aminosäure-Austausche erhöht werden kann. Den Erfahrungen in der Mutagenese von Tn5 und Himar1 folgend, ersetzte ich systematisch alle Asparaginsäure- (D) und Glutaminsäure-Reste (E) (die nicht innerhalb der Tc1-Familie konserviert sind) durch Lysin- (K) oder Arginin-Reste (R). Eine dieser Mutanten, D260K, erhöhte übereinstimmend die Sprung-Effizienz von SB um etwa 30 %. D260K zusammen mit anderen hyperaktiven Mutationen erhöht die generelle Transpositions-Effinzienz um etwa 370 % über die der Wildtyp-SB Transposase. Der Erfolg dieser site-directed Mutagenese mit limitierter Reichweite deutet darauf hin, daß großangelegte zufällige Mutagenese der SB Transposase wahrscheinlich hyperaktive Versionen mit einer bis zu 100fach gesteigerten Aktivität hervorbringen kann. Die andere Komponente des Transposon-Systems, dessen Modifikation die Aktivität verbessen könnte, ist die Transposon-DNA. Tatsächlich wurde gezeigt, daß eine Kombination aus vier Mutationen in den IRs die Aktivität des SB Transposons etwa vierfach steigert (Cui et al., 2002). Die Effizienz des SB Transposons nimmt mit steigender Transposon-Größe ab (Izsvak et al., 2000). Wir folgerten, daß eine Veränderung der Transposon- Struktur dessen Fähigkeit, längere DNA-Fragmente zu bewegen, steigern könnte. Zum Beispiel wurde beobachtet, daß ein zusammengesetztes Transposon, das aus zwei identischen Kopien von sich selbst besteht, die eine nichtrepetetive Sequenz (länger als 10 kb) in umgekehrter Orientierung flankieren, in der Fliegenart Drosophila virilis mobilisiert wird (Petrov et al., 1995). Dieses Transposon wird als Paris Element bezeichnet (Petrov et al., 1995). Duplikationen von TA-Zielsequenz-Dinucleotiden, die dieses besonders zusammengesetzte Paris Transposon flankieren (Petrov et al., 1995), weisen darauf hin, daß eine Insertion durch Transposition erzeugt wurde. Ein Konstrukt, das die Struktur des zusammengesetzten Paris Elements nachahmt, wurde aus zwei identischen Kopien des SB Transposons geschaffen, die ein relativ großes Stück DNA in einer umgekehrten Orientierung flankieren. Die inneren Bindestellen der Transposase wurden mutiert, um sicherzustellen, daß einzelne SB Einheiten nicht transposieren können. Es wurde gezeigt, daß diese Mutationen nur mit der Transpositions-Kapazität, aber nicht mit der Bindungs- Kapazität der Transposase interferieren. Dieses Konstrukt wird als Sandwich- Vektor (SA) bezeichnet. SA war fähig, dreimal effizienter zu springen als Markergene vergleichbarer Größe.