Analyse von „Extended-Spectrum“-Beta-Laktamasen und Klebsiella pneumoniae Carbapenemasen mittels Capture Compound Mass Sepectrometry

Abstract

Die wissenschaftliche Forschung zum Thema Antibiotikaresistenz bei Bakterien ist von fundamentaler praktischer Bedeutung in der modernen Medizin. ß-Laktam- Antibiotika sind die am häufigsten eingesetzten Antibiotika für die kausale Therapie bakterieller Infektionen. Der häufigste Resistenzmechanismus gegenüber ß-Laktam-Antibiotika ist die bakterielle Synthese von ß-Laktamasen, die durch die Spaltung des Laktam-Rings die antibakterielle Aktivität des Antibiotikums zerstören. Unter den ß-Laktamasen mit Aktivität gegenüber Cephalosporinen der 3. Generation kommen die ß-Laktamasen mit erweitertem Spektrum (ESBL – extended-spectrum beta-lactamases) bei medizinisch relevanten Erregern am häufigsten vor. Für die Therapie von Infektionen mit ESBL-Bildnern werden oft Carbapenem-Antibiotika eingesetzt, was wiederum zur Entstehung und Verbreitung der Resistenz gegenüber diesen Antibiotika beiträgt. Für die erfolgreiche Therapie bakterieller Infektionen wie auch für die Verhinderung der Übertragung resistenter Klone in medizinischen Einrichtungen und im Nutztierbestand sowie für epidemiologische Studien ist eine schnelle Resistenzanalyse von entscheidender Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde deshalb eine innovative Technologie – Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) – zur Anreicherung und Charakterisierung von ß-Laktamasen erprobt, mit der Perspektive, auf dieser Basis einen schnellen Nachweis dieser Enzyme direkt aus klinischem Material zu entwickeln. Capture Compound Mass Spectrometry ist eine Technologie zur funktionellen Isolierung zellulärer Makromoleküle (vornehmlich Proteine) aus komplexen Molekülmischungen (z.B. Zellextrakte) aufgrund ihrer Affinität zu spezifischen Fänger-Kleinmolekülen – Capture Compounds. Ein Capture Compound ist ein trifunktionelles Konstrukt bestehend aus i) Selektivitätsfunktion (z.B. Substrat (analogon), Inhibitor, Medikament oder Wirkstoff) zur reversiblen Bindung an das/die Zielprotein(e), ii) Photo-Reaktivitätsfunktion (z.B. aromatische Azide oder Diazirine) zur kovalenten Bindung des/der Zielprotein(e) und iii) Sortierfunktion (z.B. Biotin) zur Isolierung der Capture Compound – Protein – Konjugate mittels einer festen Phase. Die so isolierten Proteine können anschließend massenspektrometrisch charakterisiert werden. Für die vorliegende Arbeit wurde in der Fa. caprotec bioanalytics GmbH, Berlin, ein Capture Compound für die Isolierung und Charakterisierung von ß-Laktamasen, insbesondere für ESBLs und Klebsiella pneumoniae Carbapenemasen (KPC-Enzyme) konstruiert und synthetisiert. Als Selektivitätsfunktion innerhalb des Capture Compounds diente wegen seiner hohen Affinität zu ß-Laktamasen das Carbapenem- Antibiotikum Meropenem. Dabei lag Meropenem in dem Konstrukt als C3-Carboxyl- Derivat vor. Es konnte gezeigt werden, dass das Capture Compound im Vergleich zu freiem Meropenem eine um Großenordnungen schlechtere Affinität für ß-Laktamasen hatte (ca. 1/500). Deshalb war das vorliegende Capture Compound für die Anreicherung von ESBLs und KPC-Enzyme nicht geeignet. Auf der Basis unserer Ergebnisse werden Vorschläge für die Synthese alternativer Capture Compounds dargestellt.

Scientific research on the problem of bacterial resistance to antibiotics is of both fundamental and practical significance in the modern medicine. ß-lactam antibiotics are the most commonly used antibiotics against bacterial infections. The most common mechanism of resistance to ß-lactam antibiotics is the bacterial synthesis of ß-lactamases, which cleave the ß-lactam ring and, thus, inactivate the antibacterial activity of the drug. ß-lactamases with the ability to inactivate the 3rd generation cephalosprins, the so called extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs), are most common among clinically relevant bacteria. To treat infections caused by ESBL-producing bacteria, carbapenem antibiotics are used, which in turn results in resistance against this class of antibiotics. For the successful therapy of bacterial infections, for epidemiological studies and for the prevention of spreading ESBL producing bacteria both in health care facilities and livestock farming, a quick and reliable resistance analysis is necessary. Therefore, in this work, a new method - Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) – is tested to enrich and characterize ß-lactamases to enable a quick detection of these enzymes directly from clinical samples. Capture Compound Mass Spectrometry is a novel technology for functional isolation of cellular macromolecules (mainly proteins) from complex molecular mixture (e.g. cell extracts) based on their affinity to specific small capture molecules – Capture Compounds. A Capture Compound is a tri-functional small molecule consisting of i) selectivity function (substrate (analog), inhibitor, drug, active agent) reversibly binding the target protein(s); ii) photo-reactivity function (e.g. aromatic azide, diazirine) irreversibly forming a covalent bond with the target protein(s); and iii) a sorting/pull-out function (e.g. biotin) allowing to enrich the Capture Compound – protein – conjugates using a solid phase. Enriched proteins may then be analysed by mass spectrometry. In this study, a Capture Compound synthesized by caprotec bioanalytics, GmbH, Berlin, was tested for enrichment of ß-lactamases, especially ESBLs and Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPC enzymes). Due to its high affinity to ß-lactamases, the carbapenem antibiotic meropenem was employed as selectivity function within the Capture Compound. Therefore, Meropenem was derivatized at the C3-carboxylic acid moiety. This study showed that the Capture Compound exhibits a significantly reduced affinity for ß-lactamases (approx. 1/500) in comparison with free meropenem. Therefore, the present Capture Compound was not suitable for the enrichment of ß-lactamases. Based on the results of this study, syntheses of alternative Capture Compounds are suggested.