Untersuchung des Einflusses der extrazellulären Matrix auf die Ausbildung von Gallenkanaliculi und den biliären Transport in dreidimensional kultivierten Hepatozyten

Abstract

Primäre humane Hepatozyten (PHH) bilden den Goldstandard für in vitro- Untersuchungen des hepatischen Metabolismus und der Hepatotoxizität. Es ist bekannt, dass die Kultivierung von PHH in einer Sandwich-Konfiguration zwischen zwei Schichten einer extrazellulären Matrix (EZM) dazu führt, dass die PHH dreidimensional anwachsen können. Dies ermöglicht die Ausbildung von in vivo-ähnlichen Zell-Zell-Kontakten und Zell-Matrix-Interaktionen. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss verschiedener EZM-Kombinationen in Sandwichkulturen von PHH auf die Morphologie, die zelluläre Anordnung und die Ausbildung von Gallenkanalikuli sowie die Galleexkretion systematisch zu untersuchen. PHH wurden aus humanen Lebergewebeproben isoliert und anschließend für sechs Tage in Sandwich-Konfiguration zwischen zwei EZM- Schichten, bestehend aus Kollagen und/oder Matrigel, kultiviert. Diese Sandwichkulturen wurden mittels Phasenkontrast- und Immunfluoreszenzmikroskopie im Hinblick auf die Ausbildung von Zell-Zell- Kontakten und Gallenkanalikuli sowie auf die Repolarisierung der PHH untersucht. Der Einfluss der jeweiligen EZM-Kombination auf die Zellaktivität und –viabilität wurde mit Hilfe des XTT-Assays und mittels eines fluoreszensbasierten Tod/Lebend Assays analysiert. Zusätzlich wurde der biliäre Transport der Substanz CDF sowie ihre Akkumulation unter Verwendung des Live Cell Imagings untersucht. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass die Wahl der EZM-Komposition einen Einfluss auf die Morphologie, die zelluläre Anordnung und die Zellaktivität in Sandwichkulturen von PHH hat. Wurde als untere EZM-Schicht Kollagen verwendet, so zeigten die PHH eine in vivo- ähnliche Gewebearchitektur. Handelte es sich bei der oberen EZM um Kollagen, so kam es zur Formierung zahlreicher Gallenkanalikuli, wohingegen Sandwichkulturen mit einer unteren Schicht aus Matrigel und einer oberen Schicht aus Kollagen das am meisten verzweigte und stabilste Gallengangnetzwerk zeigten. In allen Sandwichkulturen konnte eine zeitabhängige CDF-Leckage aus den Gallenkanalikuli in den Zellkulturüberstand beobachtet werden, die ebenfalls eine Abhängigkeit von der EZM-Kombination zeigte. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Wahl der EZM einen Einfluss auf die Morphologie, Zellanordnung und die Ausbildung von Gallenkanalikuli in Sandwichkulturen von PHH hat. Die Morphologie und die multizelluläre Anordnung werden stark von der unteren EZM beeinflusst. Im Gegensatz dazu werden die Galleexkretion sowie Leckage hauptsächlich von der oberen EZM bestimmt. Undichte und beschädigte Gallenkanalikuli könnten vor allem in Langzeitstudien eine Limitation dieses Sandwichkulturmodells darstellen.

Primary human hepatocytes (PHH) are still considered as gold standard for investigation of in vitro metabolism and hepatotoxicity in pharmaceutical research. It has been shown that the three- dimensional (3D) cultivation of PHH in a sandwich configuration between two layers of extracellular matrix (ECM) enables the hepatocytes to adhere three-dimensionally leading to formation of in vivo like cell-cell contacts and cell-matrix interactions. The aim of the present study was to investigate the influence of different ECM compositions on morphology, cellular arrangement and bile canaliculi formation as well as bile excretion processes in PHH sandwich cultures systematically. Freshly isolated PHH were cultured for 6 days between two ECM layers made of collagen and/or Matrigel in four different combinations. The cultures were investigated by phase contrast microscopy and immunofluorescence analysis with respect to cell-cell connections, repolarization as well as bile canaliculi formation. The influence of the ECM composition on cell activity and viability was measured using the XTT-assay and a fluorescent dead or alive assay. Finally, the bile canalicular transport was analyzed by live cell imaging to monitor the secretion and accumulation of the fluorescent substance CDF in bile canaliculi. Using collagen and Matrigel in different compositions in sandwich cultures of hepatocytes, we observed differences in morphology, cellular arrangement and cell activity of PHH in dependence of the ECM composition. Sandwich cultured hepatocytes with an underlay of collagen seem to represent the best in vivo tissue architecture in terms of formation of trabecular cell arrangement. Cultures overlaid with collagen were characterized by the formation of abundant bile canaliculi, while the bile canaliculi network in hepatocytes cultured on a layer of Matrigel and overlaid with collagen showed the most branched and stable canalicular network. All cultures showed a time-dependent leakage of CDF from the bile canaliculi into the culture supernatant with variations in dependence on the used matrix combination. In conclusion, the results of this study show that the choice of ECM has an impact on the morphology, cell assembly and bile canaliculi formation in PHH sandwich cultures. The morphology and the multicellular arrangement were essentially influenced by the underlaying matrix, while bile excretion and leakage of sandwich cultured hepatocytes were mainly influenced by the overlay matrix. Leaking and damaged bile canaliculi could be a limitation of the investigated sandwich culture models in long-term excretion studies.