Lipopeptidmodifizierte Liposomen und ihre Effekte auf dendritische Zellen

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Liposomenformulierung für synthetische Lipopeptide entwickelt. Die Effekte dieser Lipopeptid-Liposomen auf zwei Arten von Antigen-präsentierenden Zellen – Makrophagen und Dendritische Zellen (DC) – wurden untersucht. Bakterielle Lipopeptide und ihre synthetischen Derivate sind Agonisten am Toll-like Rezeptor 2 (TLR2) und stimulieren als Pathogen- assoziierte molekulare Muster Makrophagen und DC. Die Liposomen wurden aus Lipoid® S100, einem Soja-Phosphatidylcholin, hergestellt. Es zeigte sich, dass Liposomen, die 10 % (m/m) Cholesterol enthielten, die beste Teilchengrößenverteilung erzielten. Die Liposomen wurden mit einem selbst synthetisierten amphiphilen Fluoreszenzfarbstoff, FITC-gekoppeltem Stearylamin, fluoreszenzmarkiert. So konnten die Liposomen und die mit ihnen behandelten Zellen fluorimetrisch, durchflusszytometrisch und fluoreszenzmikroskopisch untersucht werden. Bei Untersuchungen zur Aufnahme von Liposomen in Makrophagen der Zell-Linie THP-1 zeigte sich, dass eine positive Oberfächenladung der Liposomen keine höhere Endozytose bewirkte. Darüber hinaus zeigten die kationischen Liposomen, die das bei neutralem pH- Wert positiv geladene Stearylamin enthielten, eine ausgeprägte Zytotoxizität. Liposomenformulierungen ohne das Stearylamin dagegen waren nicht zytotoxisch, allerdings lösten sich bei Liposomenkonzentrationen über 200 µg/ml verstärkt Zellen vom Plattenboden ab. Die fluoreszenzmarkierten Liposomen wurden mit den synthetischen Lipopeptiden FSL-1, FSL-rho, OspA und BAS modifiziert. FSL-1 ist ein diacyliertes Lipopeptid, das die immunogene N-terminale Domäne des 44 kDa großen Lipoproteins LP 44 aus Mycoplasma salivarium darstellt. FSL-rho ist ein mit Rhodamin fluoreszenz-markiertes Derivat von FSL-1. OspA und BAS sind triacylierte Lipopeptide, die an der Aminogruppe des Cysteins eine weitere Palmitinsäure tragen. OspA ist ein Analogon eines Oberflächenproteins von Borrelia burgdorferi, BAS von Bacillus cereus. Eine Beladung der Liposomen mit den Lipopeptiden durch ein Hydratisieren der getrockneten Lipide mit lipopeptidhaltigem Puffer stellte sich als ineffektiv heraus. Dagegen wurden alle untersuchten Lipopeptide praktisch vollständig in Liposomen inkorporiert, wenn die Lipopeptid-Lösung der Lipid-Mischung vor der Entfernung der Lösungsmittel zugegeben wurde. Das galt sowohl für die klassische Filmbildemethode nach Bangham als auch für Methoden, bei denen die Lipide in Wasser hydratisiert, dann lyophilisiert und anschließend im Puffer erneut hydratisiert wurden (Hydration-Rehydration-Methode). Die lipopeptidhaltigen Liposomen wurden an THP-1 auf ihr Makrophagen-stimulierendes Potenzial getestet. Dabei bewirkten nur die FSL-1-Liposomen eine deutlich gesteigerte TNF-α-Produktion. Diese FSL-1-Liposomen wurden daraufhin an DC getestet, die aus Monozyten gesunder Spender erzeugten wurden (sogenannte moDC). Die Liposomen waren auch an moDC untoxisch und bewirkten keine Veränderung der Expression der DC-spezifischen Oberflächenmoleküle CD209 (DC-SIGN) und CD1a. Allerdings wurde von den FSL-1-Liposomen auch keine Reifung der moDC induziert. Unerwarteterweise wurden die in dieser Arbeit untersuchten moDC auch von gelöstem FSL-1 nicht zur Reifung stimuliert. Wurden die moDC 6 h nach der Behandlung mit FSL-1-Liposomen mit einer Mischung aus LPS und IFN-γ zur Reifung stimuliert, so exprimierten sie deutlich mehr CD80 und CD86 als nicht mit Liposomen vorbehandelte Zellen. FSL-1-Liposomen induzieren also selbst keine moDC-Reifung, führen aber bei LPS/IFN-γ-gereiften moDC zur Hoch- Regulation der Expression von co-stimulatorischen Molekülen, die zum Priming naiver T-Zellen essenziell sind.

In the study presented here, a liposomal formulation of synthetic lipopeptides was developed. The effects of these lipopeptide-containing liposomes were tested on two types of antigen-presenting cells, i.e. macrophages and dendritic cells (DC). Bacterial lipopeptides and their synthetic derivatives activate the Toll-like receptor 2 (TLR2) and act as pathogen-associated molecular patterns (PAMP) by stimulating macrophages and DC. The liposomes were made from Lipoid® S100, a soy phosphatidylcholine. The best particle size distribution could be achieved by liposomes containing 10 % (m/m) cholesterol. For fluorescence-labeling, a FITC-coupled stearyl amine was synthesized and incorporated into liposomes. Fluorescence-labeling allowed detecting and studying of liposomes as well as liposome-treated cells by fluorimetry, flow cytometry and fluorescence microscopy. Cellular uptake of liposomes was studied on THP-1 macrophages. Positive surface charge of liposomes did not result in an increased uptake by the macrophages. Additionally, the cationic liposomes which contained stearyl amine to apply the positive charge, showed a pronounced cytotoxicity. In contrast, liposome formulations without stearyl amine were not cytotoxic. Nevertheless, the tolerated liposome concentration was limited to 200 µg/ml. When higher concentrations were applied, cells were detached from the plate bottom. Fluorescence-labeled liposomes were modified with the synthetic lipopeptides FSL-1, FSL-rho, OspA and BAS. FSL-1 is a diacylated lipopeptide representing the immunogenic N-terminal domain of the 44 kDa lipopeptide LP 44 from Mycoplasma salivarium. FSL-rho is a rhodamine- labeled derivative of FSL-1. OspA is an analogue of the Outer surface protein A of Borrelia burgdorferi, BAS an analogue of a Bacillus cereus lipoprotein. Both are triacylated with a palmitic acid coupled to the cysteine’s amino group. Loading of liposomes with lipopeptides by hydrating the dried lipids with a lipopeptide-containig buffer proved to be inefficient. In contrast, lipopeptides were completely incorporated into liposomes when they were added to the lipid mixture before solvent removal. This was true for both the Thin film hydration method according to Bangham and for Hydration-rehydration methods, where the lipids are hydrated in water, then lyophilized and finally rehydrated in the respective buffer. Lipopeptide-containing liposomes were tested for their macrophage-stimulating potential on THP-1 cells. From the tested liposomal lipopeptides, only FSL-1 induced a distinct increase in TNF-α production. Therefore, FSL-1 liposomes were tested on monocyte-derived dendritic cells (moDC) of healthy donors. Liposomes were not cytotoxic to moDC and induced no alterations in the expression of DC-specific surface molecules CD209 (DC-SIGN) and CD1a. Admittedly, FSL-1 liposomes did also not induce DC maturation, nor did the soluble FSL-1. MoDC that were maturated with LPS and IFN-γ 6 h after incubation with FSL-1 liposomes, expressed distinctively more CD80 and CD86 than moDC not pre-treated with liposomes. It seems that FSL-1 liposomes themselves do not induce moDC maturation, but lead to an up- regulation of these co-stimulatory molecules essential for the priming of naive T-cells.