dc.contributor.author
Buchholz, Matthias
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:46:09Z
dc.date.available
2003-03-16T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5412
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9611
dc.description
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Lebenslauf
1\. Einleitung
2\. Literatur
3\. Material und Methoden
4\. Ergebnisse
5\. Diskussion
6\. Zusammenfassung und Summary
Literaturverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
dc.description.abstract
In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, anhand verschiedener Antigenauf-
bereitungsmethoden zur Immunisierung von Mäusen speziesspezifische monoklonale
Antikörper zum Tierartennachweis von Fleisch in erhitzten Lebensmitteln zu
gewinnen. Die eigenen Untersuchungen wurden modellhaft an Extrakten von
erhitzter Muskulatur der Tierarten Rind und Schwein durchgeführt.
Die gezielte Anreicherung und Reinigung eines Antigens zur Immunisierung war
nicht möglich, da es bisher nur unzureichende Kenntnisse über
speziesspezifische und hitzestabile Antigene in Extrakten aus erhitzter
Muskulatur gibt. Die Ergebnisse anderer Untersucher deuten sowohl auf die
Existenz von hitzestabilen spezifischen Antigenen, die bereits im Rohmaterial
enthalten sind, als auch auf spezifische Antigene, die erst durch den
Erhitzungsprozeß entstehen, hin.
Aus diesen Gründen wurden die folgenden Antigenaufbereitungsmethoden
ausgewählt, die sich in der Stärke der thermischen Belastung des
Muskelfleisches und der Extraktionsmethode unterschieden:
1\. Antigenaufbereitung 1 (Lyophilisat)
Zerkleinerte Muskulatur wurde für 15 Minuten auf 56 °C Kerntemperatur erhitzt,
anschließend lyophilisiert und 500 mg Lyophilisat mit physiologischer
Kochsalzlösung für 18 Stunden extrahiert. Die Immunisierungslösung enthielt
0,4 mg Protein je Dosis.
2\. Antigenaufbereitung 2 (nach RAVESTEIN u. DRIEDONKS, 1986)
5 g zerkleinerte Muskulatur wurden in 10 ml PBS-Puffer für 5 Minuten im 100 °C
Erkalten wurde das Präparat zentrifugiert und filtriert. Auch hier enthielt
die Immunisierungslösung 0,4 mg Protein je Dosis Wasserbad erhitzt. Dabei
wurden Kerntemperaturen von ca. 89 °C erreicht. Nach dem
3\. Antigenaufbereitung 3 (nach HITCHCOCK et al., 1981)
50 g zerkleinerte Muskulatur wurden im Autoklaven für 15 Minuten auf 110 °C
erhitzt und anschließend zu einem Aceton-Trocken-Pulver verarbeitet. Die
Extraktion erfolgte mit einer Harnstoff-Mercaptoethanollösung für eine Stunde
im 100 °C Wasserbad.
4\. Antigenaufbereitung 4 (Ultrafiltration)
Die zerkleinerte Muskulatur wurde für 30 Minuten bei einer Kerntemperatur von
ca.
98 °C erhitzt und anschließend mit Aqua dest. 24 Stunden bei 4 °C extrahiert.
Nach der Zentrifugation und Filtration wurde der Extrakt nacheinander über
Flachmembranfilter mit unterschiedlichen Molekulargewichts-Trennbereichen
filtriert. Aufgrund eigener Voruntersuchungen und von Literaturhinweisen
wurden die hochmolekularen Konzentrate ( 300 kDa und 100 ý 300 kDa) zur
Immunisierung der Mäuse eingesetzt.
Aus der Antigenaufbereitung 1 gingen zahlreiche spezifisch reagierende
Antikörper verschiedener Hybridome hervor. Ein Klon konnte etabliert werden.
Bei den weiteren Untersuchungen stellte sich heraus, dass dieser monoklonale
Antikörper nur mit dem Immunisierungsantigen spezifisch reagierte. Das Antigen
war nicht hitzestabil. Eine Erhitzung auf 60 °C reichte bereits aus, das
Antigen soweit zu denaturieren, dass es nicht mehr mit dem monoklonalen
Antikörper reagierte.
Auch mit der Antigenaufbereitung 2 konnten einige mit dem homologen Antigen
spezifisch reagierende Hybridomantikörper nachgewiesen werden. Diese zeigten
jedoch keine spezifischen Reaktionen mit den stärker denaturierten Antigenen
aus der Antigen-aufbereitung 3. Ein Klon konnte nicht etabliert werden.
Aus der Antigenaufbereitung 3 gingen überraschenderweise keine spezifisch
reagierenden Hybridomantikörper hervor. Andere Experimentatoren erzielten
gerade mit der Harnstoff-extraktion bei stark hitzedenaturierten Proben unter
Einsatz polyklonaler Antiseren gute Ergebnisse.
Am erfolgreichsten stellte sich die Antigenaufbereitung 4 heraus. Obwohl das
Antigenmaterial auch einer starken Hitzedenaturierung unterlag, wurden
zahlreiche hochspezifische Antikörper verschiedener Hybridome nachgewiesen.
Durch die Ultra-filtration konnten die hochmolekularen Proteine angereichert
und von niedermolekularen Eiweißen getrennt werden. Diese scheinen vor allem
für unspezifische Reaktionen auch in anderen Untersuchungssystemen
verantwortlich zu sein. Bei den hochmolekularen spezifisch reagierenden
Antigenen handelt es sich wahrscheinlich um Proteinaggregate, die erst durch
den Erhitzungsprozeß entstehen, und nicht um hitzestabile Antigene, die
bereits im Rohmaterial vorhanden sind. Diese Annahme wird auch dadurch
bestätigt, dass für den kommerziellen ELISA die Anwendungsvorschrift für rohe
oder gering erhitzte Proben eine Nacherhitzung für 15 Minuten im 100 °C
Wasserbad vorschreibt.
Bei den eigenen Untersuchungen stellte sich die Zellkultivierung und hier vor
allem das Etablieren von stabilen, antikörperbildenden Klonen als besondere
Schwierigkeit heraus, so konnten weitergehende Untersuchungen oft nicht mehr
durchgeführt werden.
Mit der IEF, dem kommerziellen ELISA und der PCR bzw. DNA-Sonden-Technik
stehen gute Instrumente für die Lebensmittelüberwachung zur Tierartbestimmung
auch in erhitzten Lebensmitteln zur Verfügung. Bei differenzierteren
Fragestellungen oder durch neue gesetzliche Bestimmungen kann es erforderlich
sein, auch gewebe- und tierartspezifische Antikörper für entsprechende
Untersuchungen zur Verfügung zu haben. Die Gewinnung monoklonaler Antikörper
unter Verwendung entsprechend gereinigter Antigene scheint dafür ein
erfolgversprechender Weg zu sein.
de
dc.description.abstract
The present investigation had the aim to establish monoclonal antibodies for
the detection of the animal species identity in heat processed meats. The
experiments were carried out with extracts from heated meat samples of the
bovine and porcine species.
The definite enrichment and purification of particular antigen for
immunization was not possible because there exists no sufficient knowledge
about species specific heatstable antigens in animal tissue, particularly in
muscle. Results published by other investigators point to the existence of
heat stable specific antigens already present in the raw material as well as
others that do not develop before heating.
Extraction procedures had to be varied: The antigen-enrichment-methods chosen
differed with regard to the intensity of the thermal effect on the muscle
tissue and the method of extraction.
1\. Antigen enrichment 1 (lyophilization)
Minced meat was heated for 15 minutes to a central temperature of 56 °C, then
extracted with normal saline for 18 hours. The extract used for immunization
contained 0.4 mg protein per dose.
2\. Antigen enrichment 2 (according to RAVESTEIN and DRIEDONKS, 1986)
5 g of minced meat was heated for 5 minutes in a 100 °C waterbath. Central
temperatures of about 89 °C were reached. After cooling the sample was
centrifuged and filtered. The solution for immunization contained 0.4 mg
protein per dose.
3\. Antigen enrichment 3 (according to HITCHCOCK et al., 1981)
50 g of minced meat was heated in an autoclave for 15 minutes up to 110 °C and
then prepared to aceton-dry-powder. The powder was extracted with urea-
mercaptoethanol-solution in a 100 °C waterbath for one hour.
4\. Antigen enrichment 4 (ultrafiltration)
The minced meat was heated for 30 minutes at a central temperature of about 98
°C and afterwards extracted with dist. aqua at 4 °C for 24 hours. After
centrifugation and filtration the extract was filtered step by step with flat
membrane filters separating by the order of molecular weight. According to
preliminary studies and references from the literature, higher molecular
weight fractions ( 300 kDa and 100 ý 300 kDa) were used for immunization.
From the antigen enrichment 1 many specific antibodies of different hybridomas
resulted. One single clone could be established. Further results revealed,
that this monoclonal antibody reacted specifically only with the original
antigen which was not heatstable. Heating up to 60 °C denatured the antigen to
such an extent that it did not react anymore with the monoclonal antibody.
Also, with the antigen enrichment 2 some specifically reacting hybridoma
antibodies were found. However, these did not react specifically with the more
strongly denatured antigens from antigen enrichment 3. Not one clone could be
established.
From antigen enrichment 3 no specifically reacting hybridoma antibodies were
shown. Other authors proved definitely good results with urea extraction in
heat denatured meats using polyclonal antisera.
Antigen enrichment 4 was the most successful one. Though the antigen material
was undergoing strong denaturation, many antibodies of high specificity were
detected. Ultrafiltration enriched the higher molecular weight proteins
separating them from the lower molecular weight fraction. The latter seems to
be a main cause for nonspecific reactions.
The specific reacting high molecular antigens are probably aggregates of
proteins, which only develop during heating process, rather then heat stable
antigens already present in the raw material. This supposition is supported by
the fact, that commercial ELISA kits recommend a heat process for 15 minutes
at 100 °C water temperature for raw or moderately heated samples.
During our own research the cultivation of cells, and especially the
establishment of stable antibody producing clones proved to be a special
difficulty.
IEF, commercial ELISA, PCR and DNA-probe technique are useful for
determination of animal species also in heated meat. For more detailed
investigations as well as for issues of new food regulations it might be
useful to have available tissue and species specific antibodies. The
production of monoclonal antibodies seems to be a successful way for those
purposes.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Monoclonal Antibodies
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Versuche zur Gewinnung muriner monoklonaler Antikörper zum Tierartennachweis
in Lebensmitteln unter Verwendung verschiedener Immunisierungs-
Antigenaufbereitungen
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Hans-Jürgen Sinell
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Michael F. G. Schmidt
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Ernst Hellmann
dc.date.accepted
2003-02-20
dc.date.embargoEnd
2003-04-16
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2003000672
dc.title.translated
Study on the production of murine monoclonal antibodies for the detection of
animal species identity in heat processed foods using various antigens for
immunization
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000946
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2003/67/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000946
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access