Polarisierung von naiven CD4+ T-Lymphozyten zu IL-17-produzierenden TH17-Zellen durch TLR2 stimulierte Dendritische Zellen

Abstract

Im Fokus dieser Forschungsarbeit standen einerseits die TLR-Aktivierung auf DC sowie andererseits die kürzlich zuvor beschriebene eigenständige TH17-Differenzierungslinie, deren Funktion unter anderem die Abwehr von extrazellulären Bakterien und Pilzen ist. Dazu wurden Monozyten aus Leukozyten menschlicher Vollblutspenden isoliert und anschließend MoDC sowie MoLC generiert. MoDC entsprechen den peripheren Blut-DC, während MoLC den spezialisierten Haut-DC, den LC, entsprechen. In Vorversuchen wurden analog zum Pathogenkontakt in der Haut unterschiedliche TLR-Liganden für die Stimulationsphase der DC eingesetzt. Daraufhin wurde das Zytokinprofil der aktivierten DC bezüglich TH17-relevanter Zytokine analysiert. Nach Anlegen von Kokulturen TLR aktivierter DC mit naiven CD4+ T-Zellen wurden die Zellen und deren Zellkulturüberstände mittels FACS und ELISA auf die spezifischen Expressionsmuster der TH-Zelldifferenzierungslinien untersucht. Es konnte als Ergebnis festgehalten werden, dass MoDC sowie MoLC besonders nach Aktivierung via TLR2 ein TH17-dirigierendes Zytokin-Expressionsmuster aufweisen. Hierzu produzieren sie signifikant vermehrte Mengen an IL 6, IL-1β und IL-23, während TGF-β konstitutiv unabhängig von TLR2 Stimulation sezerniert wird. Es konnte zudem eine erhöhte Expression der Reifungsmarker CCR7 und CD83 nach PGN- Stimulation in MoLC nachgewiesen werden. Dieser Effekt war ebenfalls mit dem TLR2-blockierenden Antikörper T2.5 konzentrationsabhängig inhibierbar. TLR2-aktivierte DC waren in Kokultur mit naiven CD4+ T Zellen tatsächlich in der Lage, eine signifikante TH17-Immunantwort zu generieren, während DC, die zuvor via anderer TLR aktiviert wurden, dies nicht oder nur unzureichend vermochten. Im direkten Vergleich zeigten MoLC nach TLR2-Stimulation eine stärkere TH17-Direktion als MoDC. Durch Zugabe von externem IL-6 und/oder TGF-β zeigte sich eine signifikante Abnahme der IL-17-Sekretion in den Kokulturen. Mittels MACS selektierte CD4+CD25- T-Zellen zeigten im Vergleich zu ausschließlich CD4+ isolierten T-Zellen und positiv isolierten CD4+CD25+ eine deutlich stärkere IL 17 Sekretion. Es konnte durch FACS- und ELISA- Versuche mit Hilfe neutralisierender Zytokin-Antikörper eine bedeutende Rolle von IL-1β und TGF-β während der TH17- Differenzierung nachgewiesen werden. Durch abschließende Versuche mit T2.5 konnte die Rolle des TLR2 in der Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen zu TH17-Zellen verifiziert werden. Das nachgewiesene Vorkommen von IFN zusammen mit IL-17 in TH-Zellen, steht im Einklang mit aktuellen Konzepten über die Komplexität der TH Zelldifferenzierung. Demzufolge wird eine gewisse Plastizität während der Differenzierung von TH-Zellen zugrunde gelegt, wobei die TH17-Zellen einen Platz zwischen TH1- und Treg Zellen einnehmen.

This research focused on two subjects. First, was the TLR activation on DC; secondly, the recently described independent differentiation line, TH17, whose function is, among others, the resistance of extra-cellular bacteria and fungi. Monocytes from leucocytes of human full blood donations were isolated. Afterwards MoDC as well as MoLC were generated. MoDC correspond to the peripheral blood DC, while MoLC correspond to the specified dermal DC, the LC (Langerhans cells). In pre-experiments different TLR ligands were used for the stimulation phase of the DC by analogy with the pathogen-contact in skin. As a result, the cytokine profile of the activated DC was analysed with regard to cytokines relevant for TH17. In co-cultures of TLR-activated DC with naive CD4+ T cells, the cells and their cellculture supernatant were examined for the specific expression patterns of each TH cell differentiation line by using FACS and ELISA. It was demonstrated that MoDC as well as MoLC can express cytokines directing towards TH17 after activation via TLR2. Moreover, they produce significantly increased amounts of IL-6, IL-1 β and IL-23, while TGF-β was secreted constitutively and independently of TLR2 stimulation. Furthermore, a raised expression of the maturation markers CCR7 and CD83 was proven after PGN stimulation in MoLC. This effect could be inhibited with the TLR2 blocking antibody, T2.5, depending on its concentration. TLR2-activated DC were able in co-culture with naive CD4+ T cells to generate a significant TH17 immune response, while DC which were activated before via other TLR were not or not sufficiently capable of this. In a direct comparison, following TLR2-stimulation MoLC showed a stronger TH17-directing capability than MoDC. By addition of external IL-6 and/or TGF-β a significant decrease of the IL-17 secretion could be shown. In comparison to exclusively CD4+ isolated and positively isolated CD4+CD25+ T cells, CD4+CD25- T cells isolated via MACS showed a clearly stronger IL-17 secretion. An important role of IL-1β and TGF-β during the TH17-differentiation could be proven by FACS and ELISA experiments with the help of neutralising cytokine antibodies. The significance of TLR2 in the differentiation of naive CD4+ T cells towards TH17 cells could be verified by final experiments with T2.5. The demonstrated occurrence of IFNγ simultaneously with IL-17 in TH cells concurs with the latest hypotheses about the complexity of the TH cell differentiation. Therefore, certain plasticity during the differentiation of TH cells is assumed, while the TH17 cells occupy a place between TH1 and Treg cells.