Isolierung und Charakterisierung des humanen Waisen-Kernrezeptors Germ Cell Nuclear Factor (hGCNF)

Abstract

Zusammenfassung

Zusammenfassung

Die Spermatogenese ist ein Prozeß, bei dem aus diploiden Voläuferkeimzellen reife, haploide Spermatozoen entstehen. Die molekularen Mechanismen seiner Regulation sind bisher wenig untersucht. Die cDNA des nukleären Waisen-(Orphan)-Kernrezeptors GCNF war aus der Maus isoliert worden und sein Expressionsmuster als keimzellspezifisch beschrieben worden. Daher wurde für GCNF eine Funktion bei der Keimzellentwicklung vermutet und die gezielte Einflußnahme auf seine Funktion als möglicher Ansatz einer neuartigen Fertilitätskontrolle in Erwägung gezogen.

In der vorliegenden Arbeit wird die Isolierung und Charakterisierung von humanem GCNF beschrieben. Die humane vollständige GCNF-cDNA wurde aus einer humanen Testis cDNA-Bank isoliert und zeigte eine hohe Identität mit der Maus- GCNF-Sequenz (89,1% bzw. 98,3% Identität bezogen auf die cDNA- bzw. Proteinsequenz). Das Expressionsmuster von hGCNF-mRNA wurde im Northern-Blot untersucht und ergab eine beinahe ausschließliche Expression im Testis. Um darüber hinaus die Expression von hGCNF-Protein im Testis eingehender zu untersuchen, wurden hGCNF-Fragmente in E.coli exprimiert, aufgereinigt und zur Herstellung von Antiseren verwendet. Mit Hilfe der affinitätsgereinigten Antikörper wurde GCNF im Testis von Mensch, Affe, Hund und Maus nachgewiesen. Es zeigte sich, daß GCNF keimzellspezifisch erst postmeiotisch in den runden und elongierten Spermatiden exprimiert wird. Zur Untersuchung der intrazellulären Lokalisation wurde ein hGCNF-EGFP-Fusionsprotein in HeLa- Zellen exprimiert. Es wurde eine hauptsächlich nukleäre und schwache zytoplasmatische Expression gefunden. Dieses Ergebnis wurde auch durch einen immunhistochemischen Nachweis von in HeLa-Zellen exprimiertem, vollständigem hGCNF bestätigt. In Transaktivierungsexperimenten wurde die Funktion von hGCNF untersucht. Es zeigte sich, daß hGCNF als Repressor auf die Transkription eines Reportergens wirkte. Durch die Erstellung von Deletionsmutanten konnte der repressorische Bereich auf die Ligandenbindungsdomäne eingegrenzt werden, innerhalb derer möglicherweise zwei repressorische Domänen vorliegen. Um die Interaktion von GCNF mit dem Korepressor NCoR zu untersuchen, wurden das Hefe- und Säuger-Zweihybridsystem und das GST-Pull-Down-System verwendet. In allen drei Systemen konnte die Interaktion von GCNF mit NCoR bestätigt werden. Mit Hilfe von Deletionsanalysen wurde der Interaktionsbereich von GCNF mit NCoR im GST-Pull-Down-Experiment auf drei Bereiche innerhalb der Ligandenbindungsdomäne eingegrenzt.

Abstract

Abstract

Spermatogenesis is a process in which diploid precursor cells develop into mature haploid spermatozoa. The molecular mechanisms of its regulation are not well understood. The cDNA of the nuclear orphan receptor GCNF has been isolated from mouse. Its expression profile was found to be germ cell- specific. A possible function of GCNF during germ cell development is conceivable. Therefore, GCNF is considered a possible target for fertility control.

This work describes the isolation and characterization of human GCNF. The human full-length GCNF cDNA, isolated from a human Testis cDNA-library, showed a high level of identity with the mouse GCNF sequence (89.1% and 98.3% nucleotid sequence and amino acid sequence identity, respectively). The expression profile of hGCNF mRNA, investigated by Northern blot analysis, revealed an almost exclusive expression in testis. In order to investigate the expression of hGCNF in testis in more detail, hGCNF fragments were expressed in E.coli, purified and used for generation of antibodies. By using these antibodies, it could be shown that GCNF is expressed in human, monkey, dog and mouse testis exclusively in post-meiotic round and elongated spermatocytes. To elucidate the intracellular localisation a hGCNF-EGFP fusion protein was expressed in HeLa cells. A predominant nuclear and weak cytoplasmatic expression was detected. This result was further supported by the immunohistochemical detection of full length hGCNF expressed in HeLa cells. Furthermore the function of GCNF was investigated by transactivation assays. It could be shown that GCNF acts as a repressor of transcription on reportergenes. By using deletion mutants, the repressor domain could be mapped to the ligand-binding domain, which possibly contains two repressor domains. The interaction of GCNF with the corepressor NCoR was investigated using the yeast and mammalian two hybrid system and GST-pull down experiments. The results of all three systems confirmed the interaction of GCNF with NCoR. Deletion analyses using the GST-pull down assay allowed to map the interaction region of GCNF with NCoR to three regions within the ligand-binding domain.