E2F1, -2 und -3 sind als Subklasse in der E2F-Familie als transkriptionelle Aktivatoren von zentraler Bedeutung für den G1/S-Phasenübergang. E2F1 und E2F3a sind überdies an der Regulation von DNA-Schädigungen und an der DNA- Reparatur-Mechanismen beteiligt. Die Proteine sind unter dem Einfluss von verschiedenen Stressfaktoren, wie z.B. Gamma-Strahlen durchaus auch in der Lage, die Transkription aktiv zu reprimieren. Die Reparatur dabei entstehender DNA-Doppelstrangbrüchen erfolgt durch die DNA-PK. Für die Regulation der Transkription durch E2F ist die Anwesenheit einer konservierten Protein- Domäne, der Marked Box, notwendig. Mit Hilfe von Yeast-Two-Hybrid-Experimenten konnte gezeigt werden, dass diese Domäne innerhalb des Proteins eine neue Protein-Protein-Bindungsstelle darstellt, an die regulatorische Untereinheit der DNA-PK, das Ku70-Protein, binden kann. Im Rahmen dieser Dissertation sollte charakterisiert werden, wie die transkriptionelle Aktivität von E2F1 durch die Bindung an den DNA-PK-Proteinkomplex im Zellzyklus beeinflusst wird. Dabei stand eine möglichst genaue Identifizierung der Bindungsregion von Ku70 an E2F1 im Vordergrund. Zu diesem Zweck wurden Präzipitationsuntersuchungen durchgeführt. Hierfür wurden E2F1-GST-Fusionsproteine mit unterschiedlich in der Marked Box deletierten Regionen für den Bindungspartner Ku70 verwendet. Die Region der Interaktion wurde in vitro mittels einer Biacore-Analyse bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass die konservierte Region Marked Box von E2F1 allein für die Bindung an Ku70 verantwortlich ist. Bindungsstudien zeigten zudem einen hochaffinen Charakter mit einer Bindungskonstanten von KA = 3,29*10E8 M und von einer Dissoziationskonstanten von KD = 32,6 nM dieses Protein-Komplexes auf. In einem weiteren Versuchsansatz wurde die Interaktion in vivo in Zellzyklus-Untersuchungen unter dem Einfluss von Gamma- Strahlen analysiert. Die transkriptionelle repressive Wirkung des Ku70-Ku80-E2F1-Komplexes führte dort nach der Induktion von DNA- Doppelstrangbrüchen zu einem Zellzyklus-Block in der frühen S-Phase. In Zellzyklus-Experimenten konnte diesem Protein-Komplex somit auch eine physiologische Bindung zugeordnet werden, indem der Zelle die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen ermöglicht wird, bevor sie in die nächste Zellzyklusphase eintritt. Hierbei bindet Ku E2F1 und die katalytische Untereinheit DNA-PKcs phosphoryliert E2F1. Zusammenfassend stellen die Ergebnisse einen weiteren Beitrag zur Aufklärung der zellulären Funktion von E2F1 und dem Ku70/80-Dimer dar und zeigen eine Korrelationen zwischen der Repression von E2F-abhängigen Promotoren und der Gegenwart von aktivierten Ku70/80-DNA-PK-Komplexen nach DNA-Schädigung auf.
E2F activity controls the expression of a variety of genes that encode proteins essential for DNA replication and cell cycle progression. The E2F family consists of seven members containing several highly conserved domains including the marked box . In order to identify interaction partners for E2F that bind to the marked box, a yeast two-hybrid screen was carried out by using a peptide of the transcription factor E2F3 comprising the marked box as bait. This experiment identified one of the regulatory subunit of the DNA-PK, called Ku70 as a binding partner. Binding of the Ku subunit to E2F proteins has been confirmed and E2F1 and E2F3 tested to be direct targets of the Ku70/80 heterodimer. DNA-PK, which is involved in the repair of DNA double strand breaksas well as the recombination of immunoglobin genes has recently been shown to be involved within the cell cycle control. We tested the regulatory function of E2F1 in relation to the DNA-Pk by gamma-ray induced double strand breaks on running cell cycle. The potential functional mechanism of that protein complex have to be determined. The results indicate a significant reduction of E2F transactivation potential on transient cotransfection of Ku70 and Ku80. The modulation of E2F activity by DNA-PK demonstrates a key element in blocking the G1/S phase transition in the cell cycle after DNA damage, thereby allowing DNA repair before replication.
