Dendritic Nanocarrier for the Transport of Copper Ions across Biological Barriers and their Cellular Release

Abstract

The goal of this work was to transport Cu across biological barriers as potential treatment of Cu deficiency disorders. This work investigated the biological and physicochemical properties of structurally different nanocarriers for the delivery of Cu ions to the brain. Core-shell nanoparticles (CS-NPs) based on a hyperbranched polyglycerol (hPG) core with trimethylethylene diamine (TMEDA) ligands were compared to core-multishell nanoparticles (CMS-NPs) with a hyperbranched poly(ethylene imine) (PEI) core and a doubleshell composed of alkyl- and poly(ethylene glycol) (PEG) building blocks. In the case of CS-NPs the Cu binding moieties were located in the periphery of the nanocarrier, while CMS-NPs stabilized Cu in the core. The synthesized NPs were able to encapsulate high amounts of Cu. The NPs showed low cytotoxicity and staining of the nanocarriers with proper dyes was used to follow their cellular uptake behavior. It was found that both NPs were located in the cytosol of cells, whereupon CMS-NPs entered cells via clathrine- mediated transport and CS-NPs endocytosed via another mechanism. In order to investigate whether the NPs are also able to transport Cu ions into cells, neuroblastoma cells were incubated with different concentrations of Cu-loaded NPs and the cell lysates were investigated by ICP-MS to determine the Cu content of the lysates. It was observed that both NPs were able to increase the cellular Cu level, which proves the transport of Cu by NPs by bypassing the Cu transport protein Ctr1, which is usually responsible for the Cu transport into cells. In order to release Cu from nanocarriers for potential in vivo applications, the slightly lower pH-value in the inflamed tissue of the brain in AD was chosen as a release trigger. Both NPs were able to release Cu pH-dependently, therefore, the release from CS-NP was facilitated due to the stabilization of Cu in the outermost TMEDA shell of the NPs. In contrast, the release from CMS-NPs required non-physiological pH-conditions, because the Cu ions were more shielded due to their stabilization in the PEI core of CMS- NP. Furthermore, since it was shown that Cu ions imported by NPs are accessible for biological processes, the intracellular release was proven. A cellular BBB-model was established by collaboration partners and Cu-laden NPs were tested for their permeation behavior through the BBB by ICP-MS measurements. Both types of NPs were able to transport Cu across the BBB, however, CS-NPs seem to be more suitable for in vivo application due to better cellular import behavior. In order to further shield Cu ions from the environment and to enhance the blood circulation time, diamino functionalized hPG nanocarriers were equipped with PEG units via two kinds of attachment. In one nanocarrier, the PEG units were attached onto the diamino ligand shell to yield a CMS architecture. In the other case, PEG moieties were directly linked to the hPG core to yield a core-random shell (CRS) architecture. The physicochemical characterization of CMS and CRS nanocarriers demonstrate the influence of the architecture on the Cu loading capacity, the binding strength, and pH-dependent release. Investigations by UV/Vis showed that, although both nanocarriers contained the same amount of theoretically existing complexation sites, the CMS architectures were able to stabilize 14 Cu ions per macromolecule, while the CRS system only encapsulated 5 Cu ions, probably due to the structural arrangement of the amino ligands, which might have been separated or disturbed by PEG units in CRS-System. The Cu release profiles of the nanocarriers, determined by UV/Vis spectroscopy at pH-values ranging from 8 to 2, showed that the release from CRS polymers already started at pH 7. Therefore, the Cu-binding was too weak for in vivo applications. However, the CMS architecture showed a suitable pH profile releasing the Cu at pH 4, which was also observed for CS-NP. For in vivo applications, it is important to have a complex which is also stable in the presence of other, competitive metal dications present in the blood, like Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Mg(II), and Ca(II). An excess of these ions did not replace the Cu ions in the Cu:CMS complex, which indicated the strong binding and the suitability of CMS architectures for the transport in blood. For use in in vivo applications, the size of the nanocarriers have to be in a certain range. Nanoparticles with a diameter of 6 nm to 200 nm should remain longer in the blood than particles of other sizes. Thus, DLS measurements were performed to investigate the hydrodynamic radius of the Cu-loaded and empty nanocarriers. It was observed that empty CRS particles tended to form aggregates but stayed unimolecular when Cu was complexed within the nanocarrier, while CMS systems did not aggregate as either empty particles or in the complex form and therefore should have been able to achieve a long blood circulation time. The NPs might have been too big to cross the BBB, but since NPs with a positive charge are more likely to pass the BBB, the surface charge of the nanoparticles was investigated by zeta potential measurements. It was observed that partial protonation of the amino ligands led to a permanent positive charge independent of pH. Therefore the CMS and CS architectures might be good candidates to cross the BBB. Furthermore, CRS and CMS nanocarriers were less toxic to neuroblastoma cells than CS-NPs. In conclusion, CMS-NPs are a suitable candidate for in vivo application due to their low cytotoxicity and good complexation and release profiles.

Das Ziel dieser Arbeit war es, Cu-Mangelerscheinungen wie die Alzheimer Krankheit (AD) zu adressieren und die Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu überwinden. In dieser Arbeit wurden daher biokompatible Nanoträgersysteme für Kupfer (Cu)-Ionen entwickelt und die biologischen sowie physikalisch-chemischen Eigenschaften für den Transport von Cu-Ionen über die BHS untersucht. Dazu wurden Kern-Schale Nanopartikel (CS-NP) mit Kern-Multischale Nanopartikeln (CMS-NP) verglichen. CS-NP waren auf der Basis eines hyperverzweigten Polyglycerin-Kerns (hPG), der mit Trimethylethylendiamin (TMEDA) Liganden ausgestattet war, während CMS-NP aus hyperverzweigtem Poly(ethylenimin)-Kern (PEI) und einer Doppelschale aus Alkyl- und Poly(ethylenglykol) (PEG) Bausteinen aufgebaut war. Im Fall der CS-NP befinden sich die Cu-bindenden Einheiten in der Peripherie der Nanotransporter, während CMS-NP das Cu im Kern stabilisiert. Die hergestellten NP konnten große Mengen Cu stabilisieren. Die NP zeigten geringe Zelltoxizität und durch das Anfärben mit geeigneten Farbstoffen konnte ihre zelluläre Aufnahme verfolgt werden. Dabei wurde beobachtet, dass beide NP im Zytosol der Zellen lokalisiert waren, wobei CMS- NP die Zellen durch einen Clathrin-vermittelten Transport und CS-NP über einen anderen Mechanismus endozytiert wurden. Um außerdem den Transport von Cu-Ionen durch die NP zu untersuchen, wurden Neuroblastomzellen mit verschiedenen Konzentrationen der Cu-beladenen NP inkubiert und die Zelllysate mittels ICP- MS untersucht, um den Kupfergehalt der Lysate zu bestimmen. Es wurde herausgefunden, dass beide NP eine Erhöhung des zellulären Cu-Spiegels erzielen konnten. Dies belegt, dass beide NP das Cu in die Zelle transportieren, wobei das Cu Transport Protein Ctr1, das normalerweise für den zellulären Cu Transport verantwortlich ist, umgangen wird. Um die Freisetzung des Cu vom Nanotransporter für potentielle in vivo Anwendungen zu ermöglichen, wurde der leicht niedrigere pH-Wert im entzündeten Gewebe des AD-Gehirns als Freisetzungsauslöser ausgewählt. Beide NP konnten das Cu pH-abhängig freisetzen, wobei die Freisetzung vom CS-NP durch die Stabilisierung des Cu im Äußeren der TMEDA-Schale erleichtert war. Im Gegensatz dazu, benötigte die Freisetzung vom CMS-NP nicht-physiologische pH-Bedingungen, weil die Cu-Ionen durch die Stabilisierung im PEI-Kern von CMS-NP mehr abgeschirmt waren. Außerdem wurde gezeigt, dass NP-importierte Cu-Ionen für biologische Prozesse zugänglich sind, wodurch die intrazelluläre Freisetzung bewiesen wurde. Ein zelluläres BHS-Modell wurde von Kooperationspartnern etabliert und das Permeationsverhalten der Cu-beladenen NP durch die BHS wurde mittels ICP-MS Messungen untersucht. Beide Arten von NP konnten die BHS überqueren, allerdings scheint CS-NP durch die bessere zelluläre Aufnahme geeigneter für in vivo Anwendungen zu sein. Um Cu noch besser von der Umgebung abzuschirmen und die Blutzirkulationszeit zu verlängern, wurden diaminofunktionalisierte hPG Nanotransporter durch zwei verschiedene Verknüpfungsarten mit PEG Einheiten ausgestattet. In einem Nanotransporter waren die PEG Einheiten an die Diaminoligandenschale angebracht, um eine CMS-Architektur zu erhalten. Im anderen Fall, wurde PEG direkt an den hPG-Kern geknüpft, um ein zufällige Kern-Schale (CRS) Struktur zu erhalten. Die Synthese und physikalisch- chemische Charakterisierung von CMS und CRS Nanotransportern demonstrieren den Einfluss der Architektur auf die Cu-Beladungskapazität, die Bindungsstärke und die pH-abhängige Freisetzung. Obwohl beide Nanotransporter mit der gleichen theoretischen Anzahl von Komplexierungsstellen ausgestattet sind, zeigten UV/Vis Untersuchungen, dass CMS-Architekturen 14 Cu-Ionen pro Makromolekül stabilisieren können, während das CRS-System lediglich 5 Cu-Ionen einschloss, was auf die strukturelle Anordnung der Aminoliganden zurückzuführen ist, die wahrscheinlich durch die angebrachten PEG-Einheiten in CRS-System getrennt oder gestört wurden. Die Cu-Freisetzungsprofile der Nanotransporter, die durch UV/Vis Spektroskopie bei verschiedenen pH-Werten im Bereich von 2 bis 8 bestimmt wurden, zeigten eine Freisetzung vom CRS Polymer bereits bei pH 7, daher ist die Kupferbindung in diesem Fall zu schwach für in vivo Anwendungen. Allerdings zeigte die CMS-Architektur ein passendes Freisetzungsprofil von Cu bei pH 4, was ebenso bei CS-NP beobachtet wurde. Für in vivo Anwendungen ist es wichtig, dass der Komplex auch in der Anwesenheit von anderen, konkurrierenden, im Blut vorkommenden Metall-Diakationen wie Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Mg(II) und Ca(II) stabil ist. Ein Überschuss dieser Ionen ersetzte die Cu-Ionen im Cu:CMS Komplex nicht, was auf eine starke Bindung und die Eignung der CMS-Architektur für den Transport durchs Blut hindeutet. Für die Anwendbarkeit in vivo, sollte die Größe der Nanotransporter in einem bestimmten Bereich sein. Nanopartikel mit einem Durchmesser von 6 nm bis 200 nm sind geeignet, um länger im Blut zu verbleiben als Partikel anderer Größe. Daher wurden DLS-Messungen gemacht, um den hydrodynamischen Radius der Cu- beladenen und leeren Nanotransporter zu untersuchen. Es zeigte sich, dass leere CRS-Partikel gerne aggregieren, aber unimolekular bleiben, wenn Cu in ihnen komplexiert ist. Das CMS-System andererseits zeigte weder als leerer Partikel, noch als Cu-Komplex Aggregate, weshalb eine längere Blutzirkulationszeit zu erwarten ist. Um die BHS zu überwinden könnten die NPs zu groß sein, allerdings haben NP mit positivem Charakter eine höhere Chance die BHS zu passieren, weshalb die Oberflächenladung der NP mittels Zeta- Potential-Messungen untersucht wurde. Eine partielle Protonierung der Aminoliganden führte zu einer durchgehend positiven Ladung, die unabhängig vom pH-Wert war. Dies zeigt, dass die NP möglicherweise in der Lage sind die BHS zu überwinden. Des Weiteren waren CRS und CMS Nanotransporter gegenüber Neuroblastomzellen weniger toxisch als CS-NP. Zusammenfassend sind CMS-NPs durch ihre geringe Toxizität und ihre guten Komplexierungs- und Freisetzungseigenschaften geeignete Kandidaten für in vivo Anwendungen.