dc.contributor.author
Nowag, Sabrina
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:44:50Z
dc.date.available
2014-05-16T11:14:34.664Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5393
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9592
dc.description.abstract
The goal of this work was to transport Cu across biological barriers as
potential treatment of Cu deficiency disorders. This work investigated the
biological and physicochemical properties of structurally different
nanocarriers for the delivery of Cu ions to the brain. Core-shell
nanoparticles (CS-NPs) based on a hyperbranched polyglycerol (hPG) core with
trimethylethylene diamine (TMEDA) ligands were compared to core-multishell
nanoparticles (CMS-NPs) with a hyperbranched poly(ethylene imine) (PEI) core
and a doubleshell composed of alkyl- and poly(ethylene glycol) (PEG) building
blocks. In the case of CS-NPs the Cu binding moieties were located in the
periphery of the nanocarrier, while CMS-NPs stabilized Cu in the core. The
synthesized NPs were able to encapsulate high amounts of Cu. The NPs showed
low cytotoxicity and staining of the nanocarriers with proper dyes was used to
follow their cellular uptake behavior. It was found that both NPs were located
in the cytosol of cells, whereupon CMS-NPs entered cells via clathrine-
mediated transport and CS-NPs endocytosed via another mechanism. In order to
investigate whether the NPs are also able to transport Cu ions into cells,
neuroblastoma cells were incubated with different concentrations of Cu-loaded
NPs and the cell lysates were investigated by ICP-MS to determine the Cu
content of the lysates. It was observed that both NPs were able to increase
the cellular Cu level, which proves the transport of Cu by NPs by bypassing
the Cu transport protein Ctr1, which is usually responsible for the Cu
transport into cells. In order to release Cu from nanocarriers for potential
in vivo applications, the slightly lower pH-value in the inflamed tissue of
the brain in AD was chosen as a release trigger. Both NPs were able to release
Cu pH-dependently, therefore, the release from CS-NP was facilitated due to
the stabilization of Cu in the outermost TMEDA shell of the NPs. In contrast,
the release from CMS-NPs required non-physiological pH-conditions, because the
Cu ions were more shielded due to their stabilization in the PEI core of CMS-
NP. Furthermore, since it was shown that Cu ions imported by NPs are
accessible for biological processes, the intracellular release was proven. A
cellular BBB-model was established by collaboration partners and Cu-laden NPs
were tested for their permeation behavior through the BBB by ICP-MS
measurements. Both types of NPs were able to transport Cu across the BBB,
however, CS-NPs seem to be more suitable for in vivo application due to better
cellular import behavior. In order to further shield Cu ions from the
environment and to enhance the blood circulation time, diamino functionalized
hPG nanocarriers were equipped with PEG units via two kinds of attachment. In
one nanocarrier, the PEG units were attached onto the diamino ligand shell to
yield a CMS architecture. In the other case, PEG moieties were directly linked
to the hPG core to yield a core-random shell (CRS) architecture. The
physicochemical characterization of CMS and CRS nanocarriers demonstrate the
influence of the architecture on the Cu loading capacity, the binding
strength, and pH-dependent release. Investigations by UV/Vis showed that,
although both nanocarriers contained the same amount of theoretically existing
complexation sites, the CMS architectures were able to stabilize 14 Cu ions
per macromolecule, while the CRS system only encapsulated 5 Cu ions, probably
due to the structural arrangement of the amino ligands, which might have been
separated or disturbed by PEG units in CRS-System. The Cu release profiles of
the nanocarriers, determined by UV/Vis spectroscopy at pH-values ranging from
8 to 2, showed that the release from CRS polymers already started at pH 7.
Therefore, the Cu-binding was too weak for in vivo applications. However, the
CMS architecture showed a suitable pH profile releasing the Cu at pH 4, which
was also observed for CS-NP. For in vivo applications, it is important to have
a complex which is also stable in the presence of other, competitive metal
dications present in the blood, like Zn(II), Ni(II), Co(II), Mn(II), Mg(II),
and Ca(II). An excess of these ions did not replace the Cu ions in the Cu:CMS
complex, which indicated the strong binding and the suitability of CMS
architectures for the transport in blood. For use in in vivo applications, the
size of the nanocarriers have to be in a certain range. Nanoparticles with a
diameter of 6 nm to 200 nm should remain longer in the blood than particles of
other sizes. Thus, DLS measurements were performed to investigate the
hydrodynamic radius of the Cu-loaded and empty nanocarriers. It was observed
that empty CRS particles tended to form aggregates but stayed unimolecular
when Cu was complexed within the nanocarrier, while CMS systems did not
aggregate as either empty particles or in the complex form and therefore
should have been able to achieve a long blood circulation time. The NPs might
have been too big to cross the BBB, but since NPs with a positive charge are
more likely to pass the BBB, the surface charge of the nanoparticles was
investigated by zeta potential measurements. It was observed that partial
protonation of the amino ligands led to a permanent positive charge
independent of pH. Therefore the CMS and CS architectures might be good
candidates to cross the BBB. Furthermore, CRS and CMS nanocarriers were less
toxic to neuroblastoma cells than CS-NPs. In conclusion, CMS-NPs are a
suitable candidate for in vivo application due to their low cytotoxicity and
good complexation and release profiles.
de
dc.description.abstract
Das Ziel dieser Arbeit war es, Cu-Mangelerscheinungen wie die Alzheimer
Krankheit (AD) zu adressieren und die Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu überwinden.
In dieser Arbeit wurden daher biokompatible Nanoträgersysteme für Kupfer
(Cu)-Ionen entwickelt und die biologischen sowie physikalisch-chemischen
Eigenschaften für den Transport von Cu-Ionen über die BHS untersucht. Dazu
wurden Kern-Schale Nanopartikel (CS-NP) mit Kern-Multischale Nanopartikeln
(CMS-NP) verglichen. CS-NP waren auf der Basis eines hyperverzweigten
Polyglycerin-Kerns (hPG), der mit Trimethylethylendiamin (TMEDA) Liganden
ausgestattet war, während CMS-NP aus hyperverzweigtem Poly(ethylenimin)-Kern
(PEI) und einer Doppelschale aus Alkyl- und Poly(ethylenglykol) (PEG)
Bausteinen aufgebaut war. Im Fall der CS-NP befinden sich die Cu-bindenden
Einheiten in der Peripherie der Nanotransporter, während CMS-NP das Cu im Kern
stabilisiert. Die hergestellten NP konnten große Mengen Cu stabilisieren. Die
NP zeigten geringe Zelltoxizität und durch das Anfärben mit geeigneten
Farbstoffen konnte ihre zelluläre Aufnahme verfolgt werden. Dabei wurde
beobachtet, dass beide NP im Zytosol der Zellen lokalisiert waren, wobei CMS-
NP die Zellen durch einen Clathrin-vermittelten Transport und CS-NP über einen
anderen Mechanismus endozytiert wurden. Um außerdem den Transport von Cu-Ionen
durch die NP zu untersuchen, wurden Neuroblastomzellen mit verschiedenen
Konzentrationen der Cu-beladenen NP inkubiert und die Zelllysate mittels ICP-
MS untersucht, um den Kupfergehalt der Lysate zu bestimmen. Es wurde
herausgefunden, dass beide NP eine Erhöhung des zellulären Cu-Spiegels
erzielen konnten. Dies belegt, dass beide NP das Cu in die Zelle
transportieren, wobei das Cu Transport Protein Ctr1, das normalerweise für den
zellulären Cu Transport verantwortlich ist, umgangen wird. Um die Freisetzung
des Cu vom Nanotransporter für potentielle in vivo Anwendungen zu ermöglichen,
wurde der leicht niedrigere pH-Wert im entzündeten Gewebe des AD-Gehirns als
Freisetzungsauslöser ausgewählt. Beide NP konnten das Cu pH-abhängig
freisetzen, wobei die Freisetzung vom CS-NP durch die Stabilisierung des Cu im
Äußeren der TMEDA-Schale erleichtert war. Im Gegensatz dazu, benötigte die
Freisetzung vom CMS-NP nicht-physiologische pH-Bedingungen, weil die Cu-Ionen
durch die Stabilisierung im PEI-Kern von CMS-NP mehr abgeschirmt waren.
Außerdem wurde gezeigt, dass NP-importierte Cu-Ionen für biologische Prozesse
zugänglich sind, wodurch die intrazelluläre Freisetzung bewiesen wurde. Ein
zelluläres BHS-Modell wurde von Kooperationspartnern etabliert und das
Permeationsverhalten der Cu-beladenen NP durch die BHS wurde mittels ICP-MS
Messungen untersucht. Beide Arten von NP konnten die BHS überqueren,
allerdings scheint CS-NP durch die bessere zelluläre Aufnahme geeigneter für
in vivo Anwendungen zu sein. Um Cu noch besser von der Umgebung abzuschirmen
und die Blutzirkulationszeit zu verlängern, wurden diaminofunktionalisierte
hPG Nanotransporter durch zwei verschiedene Verknüpfungsarten mit PEG
Einheiten ausgestattet. In einem Nanotransporter waren die PEG Einheiten an
die Diaminoligandenschale angebracht, um eine CMS-Architektur zu erhalten. Im
anderen Fall, wurde PEG direkt an den hPG-Kern geknüpft, um ein zufällige
Kern-Schale (CRS) Struktur zu erhalten. Die Synthese und physikalisch-
chemische Charakterisierung von CMS und CRS Nanotransportern demonstrieren den
Einfluss der Architektur auf die Cu-Beladungskapazität, die Bindungsstärke und
die pH-abhängige Freisetzung. Obwohl beide Nanotransporter mit der gleichen
theoretischen Anzahl von Komplexierungsstellen ausgestattet sind, zeigten
UV/Vis Untersuchungen, dass CMS-Architekturen 14 Cu-Ionen pro Makromolekül
stabilisieren können, während das CRS-System lediglich 5 Cu-Ionen einschloss,
was auf die strukturelle Anordnung der Aminoliganden zurückzuführen ist, die
wahrscheinlich durch die angebrachten PEG-Einheiten in CRS-System getrennt
oder gestört wurden. Die Cu-Freisetzungsprofile der Nanotransporter, die durch
UV/Vis Spektroskopie bei verschiedenen pH-Werten im Bereich von 2 bis 8
bestimmt wurden, zeigten eine Freisetzung vom CRS Polymer bereits bei pH 7,
daher ist die Kupferbindung in diesem Fall zu schwach für in vivo Anwendungen.
Allerdings zeigte die CMS-Architektur ein passendes Freisetzungsprofil von Cu
bei pH 4, was ebenso bei CS-NP beobachtet wurde. Für in vivo Anwendungen ist
es wichtig, dass der Komplex auch in der Anwesenheit von anderen,
konkurrierenden, im Blut vorkommenden Metall-Diakationen wie Zn(II), Ni(II),
Co(II), Mn(II), Mg(II) und Ca(II) stabil ist. Ein Überschuss dieser Ionen
ersetzte die Cu-Ionen im Cu:CMS Komplex nicht, was auf eine starke Bindung und
die Eignung der CMS-Architektur für den Transport durchs Blut hindeutet. Für
die Anwendbarkeit in vivo, sollte die Größe der Nanotransporter in einem
bestimmten Bereich sein. Nanopartikel mit einem Durchmesser von 6 nm bis 200
nm sind geeignet, um länger im Blut zu verbleiben als Partikel anderer Größe.
Daher wurden DLS-Messungen gemacht, um den hydrodynamischen Radius der Cu-
beladenen und leeren Nanotransporter zu untersuchen. Es zeigte sich, dass
leere CRS-Partikel gerne aggregieren, aber unimolekular bleiben, wenn Cu in
ihnen komplexiert ist. Das CMS-System andererseits zeigte weder als leerer
Partikel, noch als Cu-Komplex Aggregate, weshalb eine längere
Blutzirkulationszeit zu erwarten ist. Um die BHS zu überwinden könnten die NPs
zu groß sein, allerdings haben NP mit positivem Charakter eine höhere Chance
die BHS zu passieren, weshalb die Oberflächenladung der NP mittels Zeta-
Potential-Messungen untersucht wurde. Eine partielle Protonierung der
Aminoliganden führte zu einer durchgehend positiven Ladung, die unabhängig vom
pH-Wert war. Dies zeigt, dass die NP möglicherweise in der Lage sind die BHS
zu überwinden. Des Weiteren waren CRS und CMS Nanotransporter gegenüber
Neuroblastomzellen weniger toxisch als CS-NP. Zusammenfassend sind CMS-NPs
durch ihre geringe Toxizität und ihre guten Komplexierungs- und
Freisetzungseigenschaften geeignete Kandidaten für in vivo Anwendungen.
de
dc.format.extent
II, 104 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Cellular Release
dc.subject
Blood-brain barrier
dc.subject
Neurodegenerative diseases
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::547 Organische Chemie
dc.title
Dendritic Nanocarrier for the Transport of Copper Ions across Biological
Barriers and their Cellular Release
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Rainer Haag
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Beate Koksch
dc.date.accepted
2014-05-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000096738-3
dc.title.translated
Dendritische Nanocarrier für den Transport von Kupferionen über biologische
Schranken und ihre zelluläre Freisetzung
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000096738
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