Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Nachweis von klinisch- relevanten HLA-Antikörpern (AK) nach Nieren-Transplantation. Dabei spielen zytotoxische AK, die gegen HLA-Merkmale des Spenders gerichtet sind, eine essentielle Rolle; sie stellen bereits zur Transplantation eine absolute Kontraindikation dar, da sie eine hyperreaktive Rejektion auslösen können. Das momentanige Anliegen ist, in der Spät-Phase nach Nierentransplantation neue, nicht invasive Labormethoden zu entwickeln, um eine Transplantatabstoßung rechtzeitig zu diagnostizieren. Der Luminex-Test ist derzeit die meist verwendete Methode, die eine sehr große Sensitivität aufweist. Um diese Luminex-HLA-AK besser zu charakterisieren und sensitiver komplementbindende HLA-AK von nicht komplementbindenden zu unterscheiden, haben wir eine Modifikation des Luminex-Festphasen-Tests entwickelt. Der Nachweis erfolgt durch Detektion von der C4d-Komplementkomponente, was gut mit C4d-positiven Biopsien bei Rejektion korreliert. Ziel dieser Arbeit war diese C4d-Luminex- Modifikation zu optimieren, als Routine-Test zu evaluieren, das Prüfen der klinischen Relevanz an Patientenseren, sowie der Vergleich zwischen dem C4d- Luminex-Test mit den Standard-Methoden: Lymphozytotoxizitätstest (LCT) und Luminex-IgG. Die Ergebnisse zeigen eine sehr hohe Sensitivität und Plausibilität des C4d-Luminex-Tests. Es wurden alle Schritte des Arbeitsprotokolls, wie Inkubationszeiten, Temperatur, Waschschritte, Detektions-AK, Komplementquelle, Vorbehandlung der Testseren, ausgetestet und optimiert. Wir haben keinen erhöhten Background oder falsch positive Ergebnisse in unserem Test gefunden, auch nicht in Seren nach Rituximab- Behandlung der Patienten. Es wurde hingegen festgestellt, dass der Luminex- Screening-Test falsch negative Resultate liefern kann. Dies führt zur Empfehlung, alle dort grenzwertig positiven Seren auch mit den Luminex- Einzelantigentests Klasse I bzw. II zu untersuchen. Bei dem Vergleich zwischen C4d-Luminex-Test und den Standard-Methoden wurden interessante und nicht erwartete Resultate beobachtet: In der Gruppe von HLA-Klasse I und II negativen Patienten, wurden donorreaktive C4d-bindende HLA-AK detektiert. In der Gruppe von Patienten, die für HLA Klasse I und II AK positiv waren, wurden mittels C4d-Luminex-Test ebenso DRA gefunden, die im LCT nicht detektierbar waren. Es wurde auch beobachtet, dass mehr als die Hälfte der Seren von hoch- immunisierten Patienten, getestet im Standard-Luminex-Test, HLA Klasse I und II C4d-bindende AK aufweisen. Die Vorteile des C4d-Luminex-Tests sind die große Sensitivität und Spezifität der nachgewiesenen HLA-AK, leichte und eindeutige Auswertbarkeit, sowie der Verzicht auf Arbeiten mit Spender-Zellen. Diese Modifikationen überbrücken die Nachteile der Standard-Methoden LCT und Luminex und detektieren komplementbindende beider HLA-Ak Klassen I und II, mit einer deutlich höheren Sensitivität im Vergleich zum LCT. Der C4d-Luminex-Test kann zur Risiko-Definition bei hochimmunisierten Patienten verwendet werden, sowohl als Routine-Test wie auch als Screening-Methode eingeführt werden. Der Nachweis der Relevanz der C4d-bindenden HLA-AK im Langzeitüberleben nach Nieren-TX steht für weitere Studien noch aus.
The work described in this thesis deals with the detection of clinical relevant anti-HLA-antibodies (Ab) after kidney transplantation. Of special focus is the presence of complement-binding, donor-specific HLA-Ab which is considered contraindicative for renal transplantation due to the very high risk of hyperacute rejection. Here, we sought to develop novel non-invasive methods to prevent graft rejection in the chronic phase post transplantation. Solid-phase assays like the Luminex-assay have become popular during the past years as they appear to be very sensitive to detect anti-HLA-Ab. However, the clinical relevance of all HLA-Ab identified by Luminex assays has been a matter of debate. In order to distinguish between complement-binding and non- complement binding Ab, we modified the current commerical Luminex assay by implementing the detection of the complement component C4d. The presence of this proteolytic fragment is used as a marker for antibody-mediated rejection in kidney biopsies. The aim of this work was to further optimize the newly developed C4d-Luminx modification and to implement the assay in the routine diagnostic in order to evaluate the clinical relevance of these antibodies. Finally, we compared the C4d-modification with the current reference assays: complement-dependent cytotoxicity (CDC) and the Luminex-IgG solid phase assay. Our results show that the C4d-Luminex-assay harbors high sensitivity and the detected antibodies were found to be plausible. First, we optimized many assay parameters including time of incubation, temperature, washing steps, choice of antibodies, complement source, and pretreatment of the patient sera. Interestingly, we found no considerable background or false positive results in sera from patients treated with Rituximab. In contrast, we identified that the standard Luminex screening assay "Mix" provides false negative results, compared to our new modification. Therefore, we recommend the additional specification of HLA-Ab by single antigen assays when the Luminex screening assay identifies HLA specificities that are close to the detection threshold (gray area). Moreover, we found unexpected results in sera of some patients tested "positive" by Standard-Luminex for HLA class I and II Abs, but that were negative by the cell-based reference method CDC: These sera were also positive for donor-specific C4d-binding Abs, suggesting that our novel C4d- assay is more sensitive than CDC. The benefits of the newly developed C4d- Luminex assay are the combination of high sensitivity and high specifity, the conclusive and user-friendly identification of the Ab specifities, and that it is independent of the isolation of donor cells. Our modified C4d-assay can reliably detect both, class I and class II complement-binding HLA-Abs. In the foreseeable future this modified assay can serve as a means for risk definition in highly sensitized patients. The clinical relevance of C4d- binding Luminex-Abs should be proved by further prospective studies for long time outcome after kidney transplantation.
