Im Zuge der Energiedebatte steht Wasserstoff als potentieller Energiespeicher und saubere, erneuerbare Energiequelle im Fokus derzeitiger Untersuchungen. H2 dient diversen Organismen als Energielieferant, dafür nutzen sie u.a. Hydrogenasen. Deren Fähigkeit, Wasserstoff in Protonen und Elektronen zu spalten, ist für katalytische Anwendungen interessant, vor allem da spezielle Exemplare auch unter Luftsauerstoff aktiv bleiben können. Das Knallgasbakterium Ralstonia eutropha nutzt H2 auf diese Weise als Energiequelle und weist gleich drei Enzyme auf, die gegen eindringenden Sauerstoff umempfindlich sind: die membrangebundene (MBH), die NAD+-reduzierende (SH) und die regulatorische (RH) Hydrogenase. Die Gründe der Toleranz sind erst teilweise bekannt und Gegenstand aktueller Forschung. Die [NiFe]-Hydrogenasen enthalten unterschiedliche Kofaktoren – das aktive Zentrum und die Cluster der Elektronentransferkette –, die im Verlauf ihrer katalytischen Aktivität und im Umgang mit Sauerstoff diverse Redoxzustände durchlaufen. Einige treten paramagnetisch in Erscheinung, so dass sich Elektronenspinresonanzspektroskopie (EPR) als Untersuchungsmethode anbietet. Mit EPR und verwandten Techniken können selektiv die Interaktionen ungepaarter Elektronen mit ihrer unmittelbaren Umgebung charakterisiert werden: Durch Q- und X-Band-PEANUT-Messungen an der MBH wurden die Spinzustände der am FSE beteiligten Cluster im reduzierten wie oxidierten Zustand festgestellt. Q -Band-Einkristall-EPR der oxidierten MBH ermöglichte die Bestimmung der g-Achsenorientierung des [NiFe]-Zentrums sowie die Abschätzung der Austauschkopplungen zwischen aktivem Zentrum, proximalem und medialem Cluster. Relaxationsmessungen zeigten, dass sich die Relaxationszeiten der Cluster durch diese J-Kopplungen einander angleichen. Mit Q-Band-ENDOR wurde sowohl eine Bindung des oxidierten, proximalen Clusters an das Proteinrückgrat nachgewiesen als auch die 57Fe-Hyperfeinparameter von proximalem und medialem Cluster. X-Band-ESEEM zeigte eine zusätzliche, mutmaßlich durch ein Hydroxid vermittelte, Bindung des oxidierten [4Fe3S]-Clusters an ein nahes Histidin. Isotopenausgetauschte Proben und proximale wie mediale Mutationsvarianten ermöglichten die Zuordnung der verschiedenen Signale zu den entsprechenden Clustern. In der Brückenposition des aktiven Zentrums der SH wurde mit Q-Band- ENDOR- und X- Band-HYSCORE-Messungen an 1H2O- und 2H2O-enthaltenen Proben im Nia–C-Zustand ein photodissoziierendes Hydrid nachgewiesen und charakterisiert. X-Band-ESEEM- und -HYSCORE-Untersuchungen deckten zudem ein ungewöhnlich gebundenes Histidin in der zweiten Koordinationssphäre des aktiven Zentrums auf.
As part of the current energy debate, hydrogen is at the centre of attention of ongoing investigations. It is seen as a possible energy storage and clean renewable energy source. The molecule itself is used as energy supply by different organisms, e.g. by deploying so-called hydrogenases. Their ability to cleave hydrogen into protons and electrons is interesting for catalytic applications, particularly as some of them maintain their activity even under the influence of atmospheric oxygen. The “knallgas” bacterium Ralstonia eutropha thus uses hydrogen as an energy source and exhibits three kinds of those oxygen-insensitive enzymes: a membrane-bound (MBH), a NAD+-reducing (SH) and a regulatory (RH) hydrogenase. The reasons for their tolerance are only partially known and are subject of current research. Those [NiFe] hydrogenases contain different cofactors, in particular the active site and the clusters of the electron transfer chain, which undergo various redox states in the course of their catalytic activity and while dealing with oxygen. Several of them can be paramagnetic, pointing to electron spin resonance spectroscopy (EPR) as a well-suited method of investigation. With EPR and related techniques interactions of unpaired electrons with their immediate environment can be revealed and characterised selectively: Via Q- and X-band PEANUT measurements on the MBH the spin states of the clusters involved in the FSE signal in both the reduced and oxidised state were identified. Q-band single-crystal EPR on the oxidised MBH allowed for the determination of the [NiFe] centre’s g axes orientation and permitted an estimation of the exchange interactions between the active site, proximal and medial cluster. Relaxation measurements showed the convergence of the clusters’ relaxation times due to these J couplings. Q-band ENDOR investigations could detect both a bond of the oxidised proximal cluster to the protein backbone and the 57Fe hyperfine parameters of the proximal and medial cluster. With X-band ESEEM an additional bond of the oxidised [4Fe3S] cluster to a nearby histidine was found, which is presumably mediated by a hydroxide. Isotope-exchanged samples and proximal and medial mutation variants helped to assign the various signals to the corresponding clusters. While in the Nia–C state, in the bridging position of the SH’s active site a photo-dissociating hydride was detected and characterised by Q-band ENDOR and X-band HYSCORE measurements on 1H2O and 2H2O-containing samples. X-band ESEEM and HYSCORE data additionally showed an anomalously bound histidine in the second coordination sphere of the active site.