Dynamics and mechanisms of blood-brain barrier dysfunction, cell damage and altered cerebral perfusion after cortical photothrombosis

Abstract

Focal cerebral ischemia is one of the main causes of death and disability worldwide. An ischemic core and a surrounding dysfunctional region that is susceptible to cell injury often characterize the lesion. Assessing the propensity of the peri-ischemic brain to undergo secondary damage, understanding the underlying mechanisms, and adjusting treatment accordingly remain clinically unmet challenges. A significant hallmark of the peri- ischemic brain is a dysfunctional blood–brain barrier (BBB), yet the role of disturbed vascular permeability in stroke progression and for functional outcome is largely unclear. Here I describe a longitudinal in vivo fluorescence imaging approach for the evaluation of cortical perfusion, BBB dysfunction, free radical formation and cellular injury in the cortical photothrombosis model in male Sprague Dawley rats. In this model light- activated (532 nm) Rose Bengal initiates clot formation thereby preventing sufficient perfusion to the site of illumination. Cerebral perfusion and BBB permeability were quantified from intra- and extravascular distribution kinetics of fluorescein sodium salt following its intravenous bolus application. In parallel, propidium iodide − a membrane integrity marker − served as a cell damage marker and was compared to staining with annexin V, which binds to phosphatidylserin following its exposure on the outer leaflet of the membrane during cellular injury and death. Reactive oxygen and nitrogen species were visualized using ROSstar 650 and 4-amino-5-methylamino-2’,7’-difluorofluorescein diacetate and reduced using phenyl-N-t-butylnitrone, L-NGnitroarginine methyl ester and carboxy-PTIO. Imaging the peri-ischemic area demonstrated propagation and progression of hypoperfusion, BBB dysfunction and cell damage during the 3 hour monitoring period following photothrombosis. While hypoperfusion was identified within a belt of ~400 μm surrounding the ischemic core, blood-brain barrier dysfunction and cell damage also occurred at greater distances. Nitric oxide formation most prominently occurred in arterioles, whereas superoxide and hydroxyl radicals gave a diffuse peri-ischemic parenchymal signal. Inhibiting free radical signaling significantly reduced progressive cellular damage after photothrombosis, with no significant effect on blood flow changes and increases in BBB permeability. Of note, cellular injury was only prevented in normally perfused more distant peri-ischemic brain regions (> 400 μm away from the ischemic core). Hence our data is in agreement with previous studies stressing perfusion based imaging as insufficient to detect tissue at risk. Measurements of BBB permeability could serve as a novel approach to predict lesion progression. In addition, our approach allows a dynamic follow-up of cellular events and their response to therapeutics in the acutely injured cerebral cortex.

Schlaganfall ist weltweit eine der Hauptursachen von Morbidität und Mortalität. Ein ischämischer Kern und eine weiter gefasste funktionsgestörte Region, in der es zu sekundärem Zellschaden kommen kann, kennzeichnen dieses Krankheitsbild. Die Anfälligkeit für sekundären Zellschaden zu erfassen, zugrunde liegende Mechanismen herauszufinden und Therapien entsprechend anzupassen, bleiben jedoch Herausforderungen der gegenwärtigen Forschung. Eine eingeschränkte Blut-Hirn-Schranken-Funktion ist im peri-ischämischen Gewebe üblich. Es bleibt jedoch weitgehend unklar, inwieweit diese zur Vergrößerung des Infarktkerns beiträgt und dadurch die klinische Genesung beeinflusst. In dieser Arbeit beschreibe ich eine longitudinale Methode der in vivo Fluoreszenzbildgebung zur Evaluierung des zerebralen Blutflusses, der Blut- Hirn-Schranken- Permeabilität, der Bildung freier Radikale und des Zelltodes im kortikalen Photothrombosemodell an männlichen Sprague Dawley Ratten. In diesem Modell führt lichtaktiviertes Bengalrosa zur Thrombusformation und verhindert so die ausreichende Blutzufuhr in zuvor illuminiertes Gewebe. Die zerebrale Perfusion und die Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität wurden anhand der intra- und extravaskulären Verteilungskinetik von zuvor intravenös injiziertem Fluoresceinsalz quantifiziert. Parallel diente Propidiumjodid, ein Membranintegritätsmarker, als Indikator für Zellschaden. Dieser wurde mit einem zweiten Marker, Annexin V, verglichen. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, welches bei Zellschaden und -tod vom Zellinneren an die äußere Lage der Lipiddoppelmembran transloziert wird. Sauerstoff- und Stickstoffradikale wurden durch die Farbstoffe ROSstar 650 und 4-Amino-5-Methylamino-2’,7’-Difluorofluorescein-Diacetat sichtbar gemacht, und deren Vorkommen im Gewebe bzw. deren Bildung wurde durch Phenyl-N-t-butylnitron,L-NG-Nitroargininmethylester und Carboxy-PTIO reduziert. Das peri-ischämische Gewebe wurde für drei Stunden nach Induktion der Photothrombose bildgebend überwacht. Innerhalb dieses Zeitraums kam es zu Propagation und Progression von Hypoperfusion, Blut-Hirn-Schrankenstörung und Zellschaden. Während hypoperfundiertes Gewebe nur in einem Abstand von ca. 400 μm um den Infarktkern detektiert wurde, war auch weiter entferntes Gewebe von einer Blut-Hirn-Schranken-Störung und Zellschaden betroffen. Stickstoffmonoxid stieg am prominentesten in Arteriolen an, während Superoxid- und Hydroxylradikale ein diffuses parenchymales peri-ischämisches Signal gaben. Die Blockade freier Radikale reduzierte die Progression von Zellschaden, hatte jedoch weder Einfluss auf die Perfusion noch auf die Blut-Hirn-Schranken- Permeabilität. Interessanterweise wurde die Ausbreitung des Zellschadens nur in normal perfundiertem peri-ischämischem Gewebe (> 400 μm vom Infarktkern entfernt) reduziert. Damit stimmen die Daten mit solchen Studien überein, die betonen, dass perfusionsbasierte Bildgebung nur unzureichend erfasst, ob Gewebe von Sekundärschaden bedroht ist. Messungen der Blut-Hirn- Schrankenpermeabilität könnten als zusätzlicher neuer Ansatz zur Abschätzung der Schadensprogression dienen. Die longitudinale Bildgebung, wie hier im Tiermodell beschrieben, macht es möglich, zelluläre Ereignisse im akut geschädigten Hirngewebe in ihrer Dynamik zu überwachen und den Effekt möglicher Therapeutika zu überprüfen.