Etablierung der Realtime-PCR zur Charakterisierung der Effekte von TNF-a auf die mRNA-Expression des mit kutanen Lupus-Manifestationen assoziierten Autoantigens Ro/SSA52 in humanen Keratinozyten

Abstract

Der systemische Lupus erythematodes ist eine klassische Autoimmunerkrankung, die unterschiedliche Organe betrifft und durch das Vorkommen einer Vielzahl von Autoantikörpern, die u.a. gegen nukleäre und zytoplasmatische Autoantigene gerichtet sind, gekennzeichnet ist. Autoantikörper gegen das nukleäre Ribonukleoprotein Ro/SSA sind überdurchschnittlich häufig mit photosensitiven Hauterscheinungen assoziiert und werden in 50% der Seren von Patienten mit SLE sowie in mehr als 80% der Seren von Patienten mit Sjögren-Syndrom, subakut kutanem Lupus sowie neonatalem Lupus detektiert. Die dabei entstehenden Ro /SSA-Immunkomplexe lassen sich insbesondere in der Epidermis von SLE-Patienten nachweisen 104,105. Zytokine wie TNF- sind an der Membranexpression des intrazellulären Ro/SSA52-Proteins in humanen Keratinozyten beteiligt 30,106. In dieser Arbeit wurde eine Methode zur quantitativen Bestimmung der Ro/SSA52 -mRNA-Expression in humanen Keratinozyten etabliert. Durch die Realtime-PCR können mittels relativer Quantifizierung und interner Kontrolle durch GAPDH hochsensitiv Ro/SSA52-mRNA-Produkte detektiert werden. Das Maximum der Ro/SSA52-mRNA-Expression wird in primären Keratinozyten wie auch in der humanen Keratinozytenzelllinie HaCaT nach 4h erreicht. Die Keratinozyten verschiedener gesunder Personen sind hierbei unterschiedlich empfindlich auf die Behandlung mit dem Zytokin. In der HaCaT-Zelllinie lässt sich eine deutlich höhere Ro/SSA52-mRNA-Expression als in primären Zellen beobachten. Die Induktion der Ro/SSA52-mRNA-Expression wird über den TNF-Rezeptor I vermittelt, während der TNF-Rezeptor II die über den TNF-Rezeptor I hervorgerufene Expressionserhöhung von Ro/SSA52-mRNA unterdrückt. TNF- induziert die Freisetzung von sekundären proinflammatorischen Zytokinen wie IL-6 und IL-8 sowie die des antiinflammatorischen Zytokins IL-10. Darüber hinaus fördert TNF- in primären Keratinozyten nach 24h Stimulation seine eigene vermehrte Freisetzung und ist 100-fach erhöht nachweisbar. IL-6 und IL-8 weisen eine maximale Freisetzung schon nach 4h auf und sind siebenfach bzw. 20-fach erhöht detektierbar. Die Realtime-PCR ist eine sehr sensitive Methode zur Bestimmung der mRNA-Expression des Ro/SA52-Autoantigens in Keratinozyten, die anderen bislang verwendeten Methoden wie der konventionelle PCR oder dem Northern-Blot überlegen ist. Die Effekte von TNF- auf die Induktion von Ro/SSA52-mRNA zusammen mit schon publizierten Daten zur Ro/SSA52-Proteinexpression 30,127 deutet auf eine bedeutende Rolle von TNF- bei Anti-Ro/SSA-assoziierten, inflammatorischen Hautmanifestationen bei Patienten mit Lupus erythematodes hin. Der wesentliche pathophysiologische Einfluss des Zytokins lässt den therapeutischen Einsatz von TNF--Blockern bei photosensitiven, Anti-Ro/SSA-assoziierten kutanen Formen des Lupus erythematodes vielversprechend erscheinen.

Anti-nuclear antibody response is a frequent feature among a number of systemic autoimmune diseases such as SLE or Sjögrens-Syndrome (SS). The immune response in patients with rheumatic autoimmune diseases is remarkably focussed on a particular group of nuclear self-antigens, including U1-RNP, Sm and Ro/SSA. Reasons to explain why nucleoprotein complexes are most prominent detected by autoantibodies remain unclear and are addressed to some extent by their intracellular localization, high charge and immune-stimulatory capacity of RNAs. Moreover, the immunogenicity was interpreted by the release of dominant self-antigens from dying cells and accumulation on the surface of apoptotic blebs, which led to an enhanced binding of autoantibodies. Commonly used cells which have been chosen to explore Ro/SSA autoantibody binding are skin keratinocytes. They vastly are detectable in the epidermal skin compartment and are constantly in touch with external stimuli providing comprehensive innate immune mechanisms. Anti-Ro/SSA autoantibodies, produced in photosensitive LE may contribute directly in the pathogenesis, elucidated by promotion of cell death in different target organs and by their deposition in peripheral skin. Approximately 70% of the initial cohort of patients with cutaneous Lupus (SCLE) either displayed abnormal amounts of anti-nuclear antibodies (ANA) as well as anti-Ro/SSA-antibodies. The frequency of other autoantibodies usually found in SLE patients such as double-stranded DNA and Sm were seen far below to anti-Ro/SSA autoantibodies found in SCLE patients. The deposition of IgG`s is apparently a common event in the skin of patients with systemic or cutaneous lupus erythematosus. In about 90% of chronically skin lesions and in about 60% of acute skin lesions immunoglobulins permanently have been deposited. With regard to the complex nature of the Ro/SSA autoantigen and its ubiquitous expression in mammalians, makes it challenging to investigate how either the entire Ro/SSA autoantigen complex or its merely protein components are exposed to autoantibodies. Concerning the work of Dörner et al., inflammatory cytokines such as TNF- were identified to induce the protein expression of Ro/SSA on primary human keratinocytes. In the past decade the knowledge about mechanisms underlying reinforced accumulation of the Ro/SSA autoantigen on apoptotic cells had been significantly improved [13, 35, 36], while its mRNA and protein expression on viable cells in most instances remained unsettled. By using highly sensitive real time PCR, TNF--induced mRNA expression of Ro/SSA52 in non-apoptotic primary keratinocytes and in keratinocyte cell line HaCaT was investigated. Ro/SSA52 mRNA expression peaked at 4h and is up-regulated by TNF-RI and inhibited by TNF-RII. The TNF--induced enhanced mRNA expression resulted in an elevated Ro/SSA52 protein expression after 24h. Although a small number of viable cells relocate Ro/SSA52 mRNA on the cell surface, the activated, anti-Ro/SSA52 antibody-mediated cytotoxicity (ADCC) provided the evidence of the Ro/SSA52 protein functionality. We conclude that irrespective of induction of apoptosis, Ro/SSA52 keratinocyte expression on viable cells may contribute to the development of autoantibody-mediated photosensitive skin manifestations as well as to the induction or maintenance of autoimmune responses.