Effects of antimicrobial feed additives as pre-harvest intervention measure to reduce Campylobacter coli in pigs

Abstract

The main objective of the present thesis was to investigate the impact of the dietary supplementation of the probiotic Enterococcus faecium (E. faecium) NCIMB 10415 and different zinc oxide (ZnO) concentrations on the Campylobacter (C.) coli burden in pigs (Chapter 3). Chapter 2 provides a detailed literature review that emphasises the importance of pigs as a reservoir for Campylobacter spp. and thus, for possible human Campylobacter infections. Moreover, this chapter introduces possible pre-harvest intervention strategies to reduce the C. coli load in pigs for improved veterinary public health: Campylobacter spp. are a major cause of foodborne diarrhoeal disease in humans worldwide. Thermophilic Campylobacter spp. have their natural reservoir in warm-blooded animals with C. coli as the dominant species in pigs. The prevalence of C. coli in pig herds varies between 50 and 100% with excretion rates of up to 107 cfu/g faeces. Several studies showed that up to 10% of pork meat and pork products at retail are contaminated with Campylobacter spp. Moreover, C. coli accounts for 5–10% of the human Campylobacter infections. Thus, during the slaughter process, Campylobacter spp. can be transmitted to the carcass and subsequently to humans through the consumption of contaminated pork. Hence, there is an urgent need for proper intervention measures to reduce human C. coli infections. As Campylobacter spp. do not grow outside the host, a decreased contamination of Campylobacter spp. of the final product is best achieved if the colonisation in live animal can be prevented or reduced. The administration of antimicrobial feed additives as pre-harvest intervention measure are currently being intensively explored. In the first step of the presented thesis, a Campylobacter spp. colonisation model in pigs was established. It enabled the examination of the C. coli colonisation of different sites within the pig gut which might serve as risk factors for the carcass contamination during slaughter (Chapter 4). Therefore, pigs were experimentally inoculated with the porcine C. coli 5981 strain. Then, the Campylobacter spp. excretion dynamics, the C. coli colonisation rates within different gut sections along the gastrointestinal tract and the translocation to extragastrointestinal sites was studied. Based on this colonisation model, the impact of the dietary supplementation of different ZnO concentrations and the probiotic E. faecium NCIMB 10415 to reduce the faecal C. coli load was tested in weaned piglets (Chapter 5 & 6). The diet of weaned piglets was supplemented with three levels of ZnO (40, 100 and 3,100 mg ZnO/kg feed) and with two levels of E. faecium NCIMB 10415 (0 and 109 cfu/kg feed). In both feeding trials, all piglets were naturally colonised with C. coli with excretion rates of 103–108 cfu/g faeces. The results of the colonisation trial revealed that the entire gastrointestinal tract, but also gut-associated lymphatic tissues constitute big reservoirs for C. coli and serve as potential reservoirs for the carcass cross-contamination during slaughter. Furthermore, we were able to demonstrate that only the dietary supplementation of 3,100 mg ZnO/kg feed, but not E. faecium, led to significant reduced faecal C. coli counts in pigs. Supplementation of the postweaning diet with this pharmacological dose significantly reduced the C. coli excretion level by 10-fold within one week (p = 0.001) compared to piglets that received a low and medium ZnO diet. The reduction of C. coli excretion by high ZnO has been shown to be a transient phenomenon and only lasts as long as the ZnO feeding remains high. Reducing the pharmacological concentration of 3,100 mg ZnO/kg feed to the physiological requirement of 100 mg ZnO/kg feed led to increased C. coli numbers within a few days again. A 10-fold increased zinc concentration in the faeces of pigs that were dietary supplemented with 3.100 mg ZnO/kg feed was measured compared to the control groups. Despite the negative impact on the C. coli growth in pigs fed a high ZnO concentration, several side effects must be considered: The possible elevated zinc concentration in meat and the increased zinc excretion into the environment. By in vitro growth inhibition assays a high susceptibility of C. coli against ZnO could also be observed. At concentrations ≥ 2.6 mM ZnO a decline in cell numbers occurred. It turned out that the antimicrobial activity is caused, at least partly, by the production of reactive oxygen species. The expression of catalase A, the main peroxide stress defence protein in Campylobacter spp. was up-regulated by 5-fold after ZnO treatment. Besides the activation of the oxidative stress response, the general- and heat stress response was also triggered. The expression of the chaperones clpB, groES and dnaK was up- regulated after ZnO exposure by 2.2-, 2.5- and 2.6-fold, respectively. In contrast, the expression of the zinc influx transporter znuABC and zinc efflux transporter zntA were almost unaffected after ZnO stress. In conclusion, supplementation of high dietary ZnO, but not E. faecium NCIMB 10415 significantly reduced the C. coli load in weaned piglets. A short-term dietary administration of 3,100 mg ZnO/kg feed to pigs before slaughter seems to be a promising intervention measure to reduce the C. coli load. This reduction might further lead to reduced Campylobacter spp. contamination rates of pork and subsequently to a reduced incidence of C. coli.

Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einsatz des Probiotikums Enterococcus faecium (E. faecium) NCIMB 10415 sowie verschiedener Zinkoxid (ZnO)-Konzentrationen als Futterzusatzstoffe zur Reduktion der Campylobacter (C.) coli-Belastung im Schwein zu untersuchen (Kapitel 3). Kapitel 2 stellt eine umfassende Literaturübersicht zur Bedeutung des Schweins als Reservoir für Campylobacter spp., und somit für mögliche humane Campylobacter- Infektionen dar. Darüber hinaus werden in diesem Kapitel sog. pre-harvest- Interventionsmaßnahmen zur Reduktion der C. coli-Belastung im Schwein zur Verbesserung des gesundheitlichen Verbraucherschutzes vorgestellt: Campylobacter spp. sind eine der Hauptursachen von humanen lebensmittelbedingten Durchfallerkrankungen weltweit. Thermophile Campylobacter spp. haben ihr natürliches Reservoir in warmblütigen Tieren, wobei C. coli im Schwein dominiert. Die Prävalenz von C. coli in Schweinebeständen variiert zwischen 50 und 100%, mit Ausscheidungsraten von bis zu 107 KbE/g Fäzes. Zahlreiche Studien zeigen, dass bis zu 10% des Schweinefleisches und der Schweinefleischprodukte im Einzelhandel mit Campylobacter spp. kontaminiert sind. Des Weiteren werden 5–10% aller Campylobacter-Infektionen durch C. coli verursacht. Beim Schlachtprozess können Campylobacter spp. auf die Karkassen übergehen und anschließend durch den Verzehr von kontaminiertem Schweinefleisch auf den Menschen übertragen werden. Aus diesem Grund besteht eine dringende Notwendigkeit, mit Hilfe geeigneter Interventionsmaßnahmen die humanen C. coli-Infektionen zu reduzieren. Da Campylobacter spp. sich nicht außerhalb des Wirts vermehren können, wird eine verringerte Kontamination des Endprodukts am besten erreicht, wenn die Kolonisation bereits im lebenden Tier vermieden oder verringert werden kann. Als pre-harvest-Interventionsmaßnahme wird die Verabreichung antibakterieller Futterzusatzstoffe derzeit intensiv erforscht. Zu Beginn dieser Arbeit wurde ein Campylobacter-Kolonisationsmodell entwickelt. Dieses diente zur Untersuchung der C. coli-Belastung in verschiedenen Körperabschnitten des Schweins, welche während des Schlachtens als mögliche Risikofaktoren bei der Kontamination der Karkassen dienen (Kapitel 4). Dazu wurden die Tiere mit dem porcinen C. coli 5981-Stamm experimentell inokuliert. Anschließend wurden die Ausscheidungsraten, die Kolonisationsraten der verschiedenen Magen-Darm-Abschnitte sowie die Translokationsraten von C. coli zu extra-intestinalem Gewebe untersucht. Auf diesem Kolonisationsmodell basierend wurde die Wirkung verschiedener ZnO- Konzentrationen sowie die des Probiotikums E. faecium NCIMB 10415 als Futterzusatzstoffe zur Reduktion der C. coli-Zellzahl in abgesetzten Ferkeln getestet (Kapitel 5 & 6). Dem Futter der Ferkel wurden drei ZnO- Konzentrationen (40, 100 und 3.100 mg ZnO/kg Futter) und zwei E. faecium NCIMB 10415-Konzentrationen (0 und 109 KbE/kg Futter) zugesetzt. In beiden Fütterungsversuchen waren alle entwöhnten Ferkel bereits auf natürliche Weise mit C. coli, mit Ausscheidungsraten von 103–108 KbE/g Fäzes, besiedelt. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass die Kolonisation des gesamten Magen- Darm-Trakts, aber auch Darmassoziiertes lymphatisches Gewebe beträchtliche Reservoire für C. coli, und somit für die Kreuzkontamination der Karkassen während des Schlachtens darstellen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass nur die Verabreichung von 3.100 mg ZnO/kg Futter, nicht jedoch von E. faecium, zu einer signifikanten C. coli-Reduktion im Fäzes, führte. Die Verfütterung der pharmakologischen ZnO-Dosis reduzierte die Ausscheidung von C. coli innerhalb einer Woche um ein 10-faches (p = 0,001) im Vergleich zu Ferkeln, die eine niedrige und mittlere ZnO-Diät erhielten. Diese Reduktion stellte jedoch nur ein vorübergehendes Phänomen dar und hielt nur so lange an, wie die Verfütterung der hohen ZnO-Konzentration erfolgte. Die Reduktion der pharmakologischen Konzentration von 3.100 mg ZnO/kg Futter auf den physiologischen Bedarfswert von 100 mg ZnO/kg Futter, führte zu einen Anstieg der ursprünglichen C. coli-Zellzahl innerhalb weniger Tage. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen wurde im Fäzes von Tieren in der Gruppe der hoher ZnO- Konzentration eine 10-fach erhöhte Zink-Exkretion gemessen. Trotz des negativen Einflusses der hohen ZnO-Konzentration auf die C. coli- Zellzahl müssen einige Nebenwirkungen bei der praktischen Anwendung berücksichtigt werden: Eine mögliche Erhöhung der Zink-Konzentration im Fleisch und eine erhöhte Zink-Ausscheidung in die Umwelt. Eine starke Sensibilität von C. coli gegenüber ZnO konnte auch in vitro mit Hilfe von Wachstumsversuchen beobachtet werden. Bei Konzentrationen ≥ 2,6 mM ZnO wurden bereits verringerte C. coli- Zellzahlen detektiert. Die antibakterielle Aktivität konnte, zumindest teilweise, auf die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies zurückgeführt werden. Die Expression von Katalase A, die wichtigste Peroxidase von Campylobacter spp., war durch die ZnO-Behandlung um ein 5-faches erhöht. Neben der Aktivierung der oxidativen Stressantwort wurde auch die Allgemeine Stressantwort und die Hitzestress-Antwort ausgelöst. Die Expression der Chaperone clpB, groES und dnaK wurde durch die ZnO-Exposition um ein 2,2-, 2,5- bzw. 2,6-faches hochreguliert. Im Gegensatz dazu konnte kein Unterschied bei der Expression des Zink-Influx-Transporters znuABC und des Zink-Efflux- Transporters zntA nach ZnO-Stress festgestellt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verfütterung der pharmakologische ZnOKonzentration, nicht jedoch die des Probiotikums E. faecium NCIMB 10415, zu einer signifikanten Reduktion der C. coli-Belastung im Schwein führte. Eine kurzzeitige Verfütterung von 3.100 mg ZnO/kg Futter an Schweine kurz vor der Schlachtung könnte eine vielversprechende pre-harvest-Interventionsmaßnahme zur Reduktion von C. coli darstellen. Diese könnte zu einer verminderten Kontaminationsrate von Schweinefleisch und somit zu einer verringerten C. coli-Inzidenz beim Menschen beitragen.