Functional Analysis of Autism Genes in Zebrafish: Investigation of the Autism Related 16p11.2 Deletion

Abstract

Autism refers to a large number of neurological disorders known as autism spectrum disorders (ASD). ASD patients display difficulties in social interactions and a large variety of accompanying symptoms which manifest the complex genetic background underlying this disease. To date, over 2000 copy number variations (CNVs) and 300 genes potentially linked to ASD have been identified via array-based comparative genomic hybridization. However, the physiological function of these genes and their relation to ASD is mostly unknown. This thesis examines the potential of zebrafish as being, a suitable model to functionally analyze such large number of potential neuronal disease genes and their relevance for ASD. For this thesis the most frequently reported ASD related CNV, located in the human 16p11.2 chromosomal region, was chosen for analyses. This 500 kb long CNV encompasses 27 genes of which 22 orthologs and 6 paralogs exist in the zebrafish genome. This thesis concentrated on only those zebrafish orthologs which are organized in syntenic clusters in both zebrafish and human genomes as this conservation of genomic organization indicates strong evolutionary pressure acting to preserve functionally important gene interaction and regulation. Specifically, I analyzed the zebrafish orthologs organized in two syntenic clusters on chromosome 3 consisting of the genes kctd13, sez6l2, asphd1 and ppp4ca (and ppp4cb), mapk3, gdpd3, ypel3. As a result of this thesis, it was identified that all the analyzed genes are active in the brain during development. The analysis by morpholino knockdown of: I) kctd13 and sez6l2 revealed a possible connection to ASD by induction of head size changes, II) the ppp4c genes resulted in heart and blood vessel deformations, which is in line with the heart malformations present in some 16p11.2 CNV carriers. III) mapk3 induced notochord, heart, and head deformations which are possibly related to the neuro-cardio-facial-cutaneous syndrome. IV) ypel3 and gdpd3a resulted in embryo mortality indicating their essential role during development. In conclusion, this thesis establishes the possible involvement of kctd13 and sez6l2 in ASD and more importantly serves as a case study that demonstrates the potential of zebrafish as the preferred model system for identifying and analyzing the molecular pathways involved in neurological disorders with complex genetic background such as ASD.

Autismus und weitere neurologische Erkrankungen werden heute zu den Autismus- Spektrum-Störungen (ASS) zusammengefasst. Patienten mit dieser Störung zeigen übereinstimmend Schwierigkeiten in sozialen Interaktionen, variieren jedoch stark in der Ausprägung und den Begleiterscheinungen, was sich ebenfalls in einem komplexen genetischem Hintergrund wiederspiegelt. Bisher wurden mittels der microarray-basierten vergleichenden genomischen Hybridisierung rund 2000 Ko¬pien¬zahl¬variationen und 300 Gene als potentielle Ursachen von ASS identifizierte, deren Funktion und Beziehung zu ASS unbekannt sind. Ziel dieser Arbeit ist es die Eignung des Zebrabärblings zur funktionellen Analyse großer Mengen potentieller neuronaler Krankheitsgenen und deren Zusammenhang mit ASS zu testen. Ausgangspunkt dieser Arbeit ist die bei ASS Patienten am häufigsten gefundene Kopien¬zahl¬variation in der chromo¬somalen Region 16p11.2. Diese rund 500 kb große Region beinhaltet 27 Gene, von denen 22 Orthologe und 6 Paraloge im Zebrabärblings-genom nachgewiesen sind. Um eine hohe Vergleichbarkeit zwischen Mensch und Zebrabärbling zu ermöglichen wurden die Gene zweier syntenischer Cluster für funktionelle Untersuchungen ausgewählt welche aus kctd13, sez6l2, asphd1 und ppp4ca (und ppp4cb), mapk3, gdpd3 sowie ypel3 bestehen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass alle untersuchten Gene im Gehirn der Zebrabärblinge aktiv sind. Daher wurden sie in Morpholino knockdown Experimenten auf ihre Funktion untersucht, wobei: I) kctd13 und sez6l2 eine Veränderung der Kopfgröße erzeugten, welche möglicherweise im Zusammenhang mit ASS steht, II) die ppp4c Gene Veränderungen der Herz- und Blut¬gefäss¬entwick¬lung ergaben, welche eine mögliche Verbindung mit Herz¬erkrank¬ungen einiger der 16p11.2 Deletionsträger darstellt, III) mapk3 induzierte Veränderungen an der Chorda dorsalis, dem Herzen und dem Kopf, was im möglichen Zusammenhang mit dem Neuro-Cardio-Fazio- Cutanem Syndrom steht, IV) ypel3 und gdpd3a zum Absterben der Embryonen führten, was auf eine essentielle Rolle während der Embryonalentwicklung hindeutet. Die gefundene Verbindung von kctd13 und sez6l2 mit ASS, sowie die Hinweise auf Zusammenhänge zu Erkrankungen und Embryonalentwicklung der anderen Gene zeigt deutlich das Potential des Zebrabärbling-Modells zur Analyse von molekularen Ursachen im Zusammenhang mit komplexen genetischen neuronalen Erkrankungen.