Einfluss der pharmakologischen MEK-Inhibition auf Phosphorylierung und Expression der extrazellulär-regulierten Kinasen ERK1/2 und deren Substrate nach intraluminaler Verletzung der Arteria carotis der Ratte

Abstract

Bei der Angioplastie atherosklerotischer Gefäße stellt die Restenose durch neointimale Hyperplasie auch bei Stentimplantation eine häufige Spätkomplikation dar, die durch den Einsatz spezifischer Medikamente verhindert werden soll. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass pharmakologische Inhibition der ERK/MAP-Kinasen durch lokale Applikation von PD98059 die Neointimabildung im Verletzungsmodell der A. carotis der Ratte mittels Proliferationshemmung glatter Gefäßmuskelzellen supprimiert. Western- Blot-Analysen des Zeitverlaufs der ERK1/2-Phosphorylierung und damit der Aktivierung von ERK1/2 zeigten ein triphasiges Muster mit Nachweis einer Phosphorylierung nach 10 Minuten, nach 24 Stunden und nach 4 bis 5 Tagen. Für die Regulierung der MAPK-Kaskade scheint MKP-1 in der Phase der frühen und der späten ERK1/2-Aktivierung und MKP-3 in der Phase der zweiten Aktivierung nach 24 Stunden eine entscheidende Rolle zu spielen. Bei den in-vivo-Untersuchungen wurde ein Gel mit 50 Mikromol PD98059 einmalig unmittelbar nach Ballonkatheterverletzung auf die Adventitia des Gefäßes gegeben, wodurch die ERK-Phosphoylierung einen Tag nach Katheterverletzung fast vollständig verhindert wurde. Unerwartet wurde eine Verminderung der ERK-Proteinexpression um ca. 60 % beobachtet, die zur Unterdrückung der Neointimabildung beitragen könnte. Die Proteinexpression des ERK-Zielgens Ets-1, das durch Genregulation der MMP einen entscheidenden Anteil an der Neointimabildung hat, ließ sich durch PD98059 sowohl in vitro als auch in vivo hemmen. In vivo sank die Ets-1-Proteinexpression bei behandelten Tieren an Tag 14 um mehr als 85 %. Da das Verhältnis von Apoptose zu Proliferation den Grad der Neointimaproliferation nach Angioplastie bestimmt, wurde die Expression des Proliferationsmarkers PCNA untersucht. PCNA wurde am Tag 14 ausschließlich in der Neointima nachgewiesen und durch Behandlung mit PD98059 um mehr als 85 % vermindert. Eine Apoptoseinduktion durch PD98059-Behandlung wurde durch Untersuchungen der Bax- und bcl-2-Proteinexpression ausgeschlossen. Der zur Neointimareduktion führende Effekt von PD98059 beruht demnach nur auf der Proliferationshemmung. Im Unterschied zu Sirolimus und Paclitaxel, die derzeit in drug-eluting stents eingesetzt werden, haben wir für den hier untersuchten MEK-Inhibitor PD98059 keine Hinweise auf Zytotoxizität gefunden. Eine pharmakologische MEK-Inhibition stellt nach den hier vorgelegen Ergebnissen eine Option zur Prävention der in-Stent-Restenose beim Menschen dar.

Coronary restenosis based on neointimal hyperplasia is a common late complication of angioplasty in atherosclerotic vessels also with regard to stent implantation and should be prevented by certain pharmacological agents. In this thesis, we demonstrated the pharmacological extracellular signal- regulated kinase (ERK) inhibition by local PD98059 administration. The mitogen-activated protein kinase kinase (MEK) inhibitor PD98059 suppresses the neointima formation in balloon-injured rat carotid arteries by inhibition of vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Western blot analyses of the temporal pattern of ERK1/2 phosphorylation and so ERK1/2 activation showed a triphasic activation pattern with phosphorylation 10 minutes, 24 hours and 4 respectively 5 days post injury. In mitogen-activated protein kinase (MAPK) regulation MAPK phosphatase-1 (MKP-1) seems to play a decisive role in the early and late ERK1/2 activation and MAPK phosphatase-3 (MKP-3) in the activation 24 hours post injury. In vivo pluronic gel containing 50 Mikromol PD98059, administered to the adventitia after balloon-catheter injury, suppressed ERK1/2 phosphorylation nearly completely 24 hours post injury. The decrease of 60 % in ERK1/2 protein level was not anticipated and possibly contributes to suppression of neointima formation. In vitro and in vivo induction of Ets-1, a molecular target gene of the MEK-ERK pathway, was suppressed by PD98059 and may exert part of neointima suppression by regulation of matrix metalloproteinases (MMP) expression. In vivo treatment with PD98059 resulted in suppression of more than 85 % of Ets-1 expression at day 14. We analysed the expression of the proliferation marker PCNA because the relationship between apoptosis and proliferation determines the intensity of neointimal proliferation. At day 14 PCNA was detected exclusively in neointima, and PD98059 treatment reduced PCNA expression by more than 85 %. Examinations of the protein bax and bcl-2 showed that apoptosis was not involved. Hence, attenuated neointima formation by PD98059 treatment is related to inhibition of VSMC proliferation. In contrast to sirolimus and paclitaxel, which are currently used in drug-eluting stents, we did not detect any toxic effect of the MEK inhibitor PD98059. According to the presented results, a pharmacological MEK inhibition is an option to prevent human in- stent restenosis.