Eignung unterschiedlicher Primer und DNA-Extraktionsmethoden zum PCR-Nachweis von Vertretern des Mycobacterium avium-intracellulare-Komplexes (MAIC)

Abstract

Für eine effektive Überwachung und Bekämpfung der Mykobakteriose ist eine schnelle Detektion und spezifische Identifikation des Erregers erforderlich. Aufgrund des langsamen Wachstums von Mykobakterien kann dies aus der Kultur, die als „Goldstandard“ betrachtet wird, je nach Spezies mehrere Wochen dauern. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ermöglicht eine Amplifikation von DNA in wenigen Stunden und verkürzt somit die Dauer der Diagnostik beträchtlich. Ziel dieser Arbeit war die Erarbeitung eines PCR-Modells als Grundlage für Reihenuntersuchungen von Schweinebeständen auf Vertreter des Mycobacterium avium-intracellulare-Komplexes (MAIC). In einem zweiteiligen Versuchsaufbau wurden in der Literatur beschriebene Primer und Zellaufschlussverfahren unter Verwendung von Mykobakterien-Stämmen vergleichend untersucht. Die Testung erfolgte zum einen an Verdünnungen von Reinkulturen bekannter Konzentration (Teil A), zum anderen an gespikten Lymphknotenproben (Teil B). Zum Einsatz kamen sechs Mykobakterien-Spezies/ Subspezies (M. intracellulare, M. avium subsp. avium, M. avium subsp. hominissuis, M. avium subsp. silvaticum, M. triviale, M. scrofulaceum), 10 Primerpaare und vier Zellaufschlussverfahren (Kochen, Chloroform/ Phenol-Methode, Ultraschall mit anschließendem Kochen, kommerzielles DNAExtraktionskit). Mit den verwendeten Techniken war es möglich, Vertreter des MAIC nachzuweisen, wobei sich bei den Reinkulturen bessere Nachweisraten erzielen ließen als bei Vorhandensein von Lymphknotenmaterial. Bei Reinkulturen (Teil A) erwies sich das alleinige Kochen der Probe als fast genauso effektiv wie die Ultraschallmethode mit anschließendem Kochen. Beim Routineeinsatz mit Mykobakterien-Kulturen kann deshalb die erstgenannte Methode empfohlen werden, da diese schneller durchzuführen, materialsparender und etwas kostengünstiger ist. Die Chloroform/ Phenol-Methode schnitt in Teil A schlechter ab als die beiden anderen Aufarbeitungsmethoden. Die durchschnittliche Nachweisgrenze betrug bei der Ultraschallmethode mit anschließendem Kochen 5,90 log10 KbE/ ml, beim Kochen 5,91 log10 KbE/ ml und bei der Chloroform/ Phenol-Methode 7,08 log10 KbE/ ml. Alle Primer waren bei Teil A in der Lage, die Mykobakterien, für die sie vorgesehen sind, aus der Bouillon zu detektieren. Bei Vorhandensein von Lymphknotengewebe (Teil B) erwies sich die Kochmethode zur DNA-Extraktion als ungeeignet. Hier konnten die eingemischten Mykobakterien nur in 11 von 51 Verdünnungsreihen wiedergefunden werden (= 21,6 % positiv). Der Einsatz eines kommerziellen DNA-Kits (alle 51 Ansätze positiv) oder mit Abstrichen die Chloroform/ Phenol- Methode (48 von 51 Ansätze = 94,1 % positiv) erbrachte deutlich bessere Ergebnisse. Die Nachweisgrenze war beim DNA-Extraktionskit mit durchschnittlich 7,39 log10 KbE/ ml besser als bei der Chloroform-/ Phenol-Methode (7,95 log10 KbE/ ml), für das Kochen war eine Berechnung der Nachweisgrenze aufgrund der hohen Anzahl negativer Ergebnisse nicht möglich. Als Primer zum Direktnachweis aus Lymphknotengewebe sollte die Kombination von AV 6/ 7 und IN 38/ 41 in Erwägung gezogen werden (Multiplex-PCR zum gleichzeitigen Nachweis von M. avium subsp. und M. intracellulare). Die Nachweisgrenze für den wichtigsten Vertreter M. avium subsp. hominissuis, der ca. 90 % aller Mykobakterien-Infektionen beim Schwein ausmacht, betrug mit dem Primer AV 6/ 7 in Kombination mit dem DNA-Kit 5,99 log10 KbE/ ml. Die erzielten Nachweisraten waren im Vergleich zu den allgemein in der Literatur beschriebenen PCR-Nachweisraten unbefriedigend. Vor einem Einsatz im Feldversuch sollte deshalb durch Variation verschiedener Parameter eine Verbesserung der Nachweisrate angestrebt werden. Probenaufarbeitung, DNA- Extraktion und Durchführung der PCR sind gleichermaßen der Variation zu unterziehen.

For effective monitoring and control of mycobacteriosis rapid detection and specific identification of the pathogen is required. Due to the slow growth of mycobacteria in culture, which is considered as "gold standard", it takes several weeks, depending on the species. The polymerase chain reaction (PCR) allows amplification of DNA in a few hours, and thus considerably shortens the time for diagnosis. The aim was to develop a PCR model as a basis for screening pigs to the Mycobacteriumavium- intracellulare complex (MAIC). In a two-part test set-up, primers and cell disruption procedures were compared by using different strains of mycobacteria. The testing was carried out with dilutions of pure cultures of known concentrations (part A), and with spiked swine lymph node samples (part B). The test included six mycobacterial species/ subspecies (M. intracellulare, M. avium subsp. avium, M. avium subsp. hominissuis, M. avium subsp. silvaticum, M. triviale, M. scrofulaceum), 10 primer pairs and four cell disruption methods (boiling, chloroform/ phenol method, ultrasound followed by boiling, commercial DNA extraction kit). With the used methods, it was possible to detect the members of the MAIC, with higher detection rates from the culture broth as directly from lymph node material. For pure cultures (part A), boiling of the sample was almost as effective as the ultrasound method followed by boiling. For routine work with mycobacterial cultures therefore the first method is recommended, as it is faster, material-saving and slightly cheaper. The chloroform/ phenol method in part A was worse than the other two extraction methods. The average detection limit in the ultrasound method with boiling was 5.90 log10 cfu/ ml, followed by boiling with 5.91 log10 cfu/ ml and chloroform/ phenol method with 7.08 log10 cfu/ ml. In part A, all primers were able to detect the respective mycobacteria from culture broth. With lymph node tissue (part B), boiling was inappropriate as DNA extraction method, because the added mycobacteria was only found in 11 of 51 dilution series (= 21.6 % positive). The use of a commercial DNA kit (all 51 approaches) or, to a lesser extent, the chloroform/ phenol method (48 of 51 approaches = 94.1% positive) yielded better results. The average detection limit in the DNA extraction kit was 7.39 log10 cfu/ ml, better than the chloroform/ phenol method with 7.95 log10 cfu/ ml. Calculation of the detection limit for boiling was not possible due to the high number of negative results. The combination of AV 6/ 7 and IN 38/ 41 should be considered for direct detection of atypical mycobacteria in lymph node tissue (multiplex PCR for simultaneous detection of M. intracellulare and M avium subsp.). The detection limit for M. avium subsp. hominissuis, which accounts for approximately 90% of mycobacterial infections in pigs, was 5.99 log10 cfu/ ml with the primer AV 6/ 7 in combination with the DNA extraction kit. Compared to the PCR detection rates generally described in the literature, the results of the techniques in this study were unsatisfactory. Prior to any use in a field trial, it should be attempted to improve the detection rate by varying different parameters. Sample preparation, DNA extraction and PCR procedure could be varied.