Neuronaler Zelltod durch Beta-Hämolysin

Abstract

Hintergrund und Zielsetzung: Gruppe-B Streptokokken (GBS) gehören zu den Haupterregern der peri- und neonatalen Meningitis. Die Erkrankung geht mit neurologischen Langzeitfolgen einher, die durch neuronale Schäden verursacht werden. Bakterientoxine spielen im Rahmen der intrazellulären Prozesse der Pathogenese bakterieller Erkrankungen eine Schlüsselrolle. Gruppe-B Streptokokken produzieren das porenformende Toxin ß-Hämolysin. Ziel dieser Arbeit war es, den durch ß-Hämolysin ausgelösten zytotoxischen Schaden in einer primären neuronalen Zellkultur zu untersuchen und die Schädigungsmechanismen darzustellen. Methoden: Primäre Neuronen neonataler Ratten wurden in Zellkultur mit dem gereinigtem Toxin ß-Hämolysin inkubiert. Die Neuronenschädigung wurde licht- und elektronenmikroskopisch dargestellt. Zur Untersuchung der morphologischen, ultrastrukturellen und biochemischen Veränderungen erfolgte die Fluoreszenzfärbung mit Akridinorange/Ethidiumbromid (AO/EB), der immunzytochemische Nachweis des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF), die Messung der Caspaseaktivität und die Quantifizierung des neuronalen Schadens in An- und Abwesenheit von Caspasen-Inhibition. Ergebnisse: Gereinigtes ß-Hämolysin verursachte in primären zerebralen Neuronen die charakteristischen lichtmikroskopischen und ultrastrukturellen Kennzeichen der Apoptose. ß-Hämolysin induzierte zeit- und konzentrationsabhängig neuronale Apoptose. Diese Apoptose verlief, im Gegensatz zur klassischen Apoptose, in dieser Untersuchungsreihe Caspasen-unabhängig. Eine Aktivierung der zentralen Effektorcaspase-3 lag nicht vor. Die neuronale Apoptose konnte mithilfe eines Breitspektrum-Caspaseinhibitors nicht verhindert werden. Die mitochondriale Freisetzung von AIF und seine Translokation zum Zellkern spielten eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der durch ß-Hämolysin ausgelösten neuronalen Apoptose. Schlussfolgerungen: Bakteriellen Toxinen fällt eine wichtige pathogene Rolle während invasiver bakterieller Erkrankungen zu. ß-Hämolysin löst in primären zerebralen Neuronen eine Caspasen-unabhängige Apoptose aus. Die Neutralisation bzw. Elimination dieses Streptokokkentoxins stellt eine potentielle adjuvante neuroprotektive Strategie dar, um eine Neuronenschädigung bei der GBS-Meningitis zu verhindern. Eine Inhibition des GBS-Toxins ß-Hämolysin durch den Phospholipid-Inhibitor Dipalmotyl- Phosphatidylcholin (DPPC) konnte bereits nachgewiesen werden. Der Apoptose- induzierende Faktor AIF und weitere Nicht-Caspase-Proteasen, welche die Pathogenese der durch ß-Hämolysin ausgelösten neuronalen Apoptose vermitteln, sind ein weiteres wichtiges Forschungsfeld zur Etablierung neuer adjuvanter Therapiealternativen. Eine Inhibition der Schadenskaskade könnte neuroprotektive Effekte haben.

Background and goal: Group B streptococcus (GBS) are leading causes of peri- and neonatal meningitis. GBS meningitis is associated with long-term neurological sequelae caused by neuronal damage. Bacterial toxins play a key role in the pathogenesis of bacterial diseases, especially in the context of the intracellular processes. Group B streptococci produce the pore-forming cytolytic toxin ß-hemolysin. The aim of this study was to investigate the cytotoxic damage, induced by ß-hemolysin, in a primary neuronal cell culture and to demonstrate the damage mechanisms. Methods: Primary neurons of neonatal rats in cell culture were incubated with the purified ß-hemolysin toxin. The neuronal damage was shown by light and electron microscopy. The morphological, ultrastructural and biochemical alterations were examined by fluorescence staining with acridineorange/ethidiumbromide (AO/EB), immunocytochemical detection of apoptosis-inducing factor (AIF), measurement of caspase activity and quantifying of neuronal damage in the present and absence of caspase inhibition. Results: Purified ß-hemolysin induced characteristic lightmicroscopic and ultrastructural signs of apoptosis in primary cerebral neurons. ß-hemolysin induced time- and concentration-dependent neuronal apoptosis. In contrast to the classical apoptosis, this apoptosis was caspase- independent. Activation of the central effector caspase-3 was absent. Neuronal apoptosis could not be prevented by a broad spectrum caspase-inhibitor. Mitochondrial release of AIF and its translocation to the nucleus played a crucial role in the pathogenesis of ß-hemolysin-induced neuronal apoptosis. Conclusions: Bacterial toxins play a major pathogenic role during invasive bacterial diseases. ß-hemolysin causes a caspase-independent apoptosis in primary cerebral neurons. Neutralization or elimination of this streptococcal toxin represents a potential adjuvant neuroprotective strategy to prevent neuronal damage in GBS meningitis. Inhibition of GBS toxin ß-hemolysin by the phospholipid inhibitor dipalmotyl phosphatidylcholine (DPPC) has already been demonstrated. The apoptosis-inducing factor AIF and other non-caspase proteases, which are involved in the pathogenesis of ß-hemolysin-induced neuronal apoptosis, are further important fields of research for the establishment of new adjuvant treatment alternatives. Inhibitory intervention in the biochemical cascade could have neuroprotective effects.