Untersuchung des DNA-Addukt Bildungspotentials von ausgewählten Pharmazeutika

Abstract

DNA-Addukte sind sowohl aufgrund ihrer möglichen Beteiligung an mutagenen und karzinogenen Prozessen als auch als Expositionsindikatoren gegenüber Mutagenen von großem Interesse. Für viele verschiedene umweltbedingte und arbeitsbedingt relevante Substanzen, wie zum Beispiel Benzo(a)pyren und aromatische Amine, sind verschiedene Schritte in der Krebsentstehung, ausgelöst durch DNA Adduktbildung, gut beschrieben. Pharmazeutika dagegen sind weit weniger gut untersucht. Um das Wissen über das DNA Adduktbildungspotential von Medikamenten zu erhöhen, sollten in der vorliegenden Arbeit ausgesuchte Pharmazeutika mit Hilfe des 32P-Postlabeling-Verfahren in Rattenleberschnitten untersucht werden. Es wurden Pharmazeutika ausgewählt, welche bereits mindestens 30 Jahre auf dem deutschen Markt erhältlich waren und ein Molgewicht von 100 bis 600 g/mol aufwiesen. Diese Kriterien wurden angewandt, um zu gewährleisten, dass die Latenzzeit der meisten Krebsentstehungen durchlaufen wurde und die DNA Addukte aufgrund ihrer Größe im 32P- Postlabeling-Verfahren auch detektierbar sein würden. Mit Hilfe der IARC- Klassifizierung, dem in silico DEREK-Programm und einer epidemiologischen Literaturstelle wurden die insgesamt erhaltenen 734 Substanzen weiter unterteilt und jeweils repräsentativ ausgewählt. Nach Inkubation der Pharmazeutika mit Rattenleberschnitten in einem statischen Inkubationssystem wurde die DNA isoliert. Die entstandenden DNA-Addukte wurden angereichert, mit 32P markiert und über ein Dünnschichtchromatographie-Verfahren sichtbar gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass das eingesetzte 32P- Postlabeling-Verfahren, welches für die Untersuchung von DNA-reaktiven steroidalen Substanzen optimiert wurde, in der Lage ist, DNA-Addukte verschiedener Substanzklassen zu identifizieren. Jedoch wurden bei einigen Pharmazeutika (z.B. den Alkylantien Chlorambucil, Cyclophosphamid und Melphalan), bei denen DNA Addukte erwartet wurden, keine DNA-Addukte identifiziert. Dies lässt sich höchst wahrscheinlich durch die strukturellen Veränderungen der DNA-Basen durch die Alkylierung erklären, welche zu klein waren, um mit Hilfe der Chromatographie sichtbar gemacht zu werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass das Adduktlevel und das spezifische Adduktpattern von verschiedenen Faktoren, wie z.B. Alter, Geschlecht, Gewebe und Spezies abhängig ist und die Auswertung durch das Vorkommen von I-Compound erschwert sein kann. Allerdings ermöglicht die DNA-Addukt–Analyse in Gewebeschnitten eine Untersuchung von verschiedenen Substanzen und auch Konzentrationen aus z.B. ein und derselben Leber in einem in vitro Versuch. Aufgrund des möglichen Einsatzes von verschiedenen Geweben (in dieser Arbeit: Leber und Niere) wird die Effizienz und Aussagekraft dieser Methode noch erhöht. Auch der benötigte Einsatz von nur geringen Substanzmengen bildet einen weiteren Vorteil dieses Verfahrens. Diese Analyse kann vorteilhaft zur Abklärung von Risikobewertungen bei uneinheitlichen positiven und negativen Ergebnissen aus Kanzerogentitäts- und Mutagenitätstests herangezogen werden, auch wenn sich dieses Verfahren sehr aufwendig und zeitintensiv darstellt.

DNA adducts are of interest both because of their possible direct involvement in mutagenic and carcinogenic processes and as indicators of exposure to mutagens. For several environmentally or occupationally relevant compounds, i.e. benzo(a)pyrene and several aromatic amines, the different steps in the process of carcinogenesis initiated by DNA adduct formation are well established. However, pharmaceuticals are less well investigated. To broaden the knowledge about the adduct forming potential of pharmaceuticals we selected in this thesis pharmaceuticals which should be investigated with the 32P-postlabeling assay in rat liver slices. We selected drugs which had been on the German market for at least 30 years and which had a molecular weight in the range of 100 to 600 g/mol. These criteria were chosen to ensure that the latency period of most cancers was surpassed and that because of their volume the DNA-adducts would be detectable in the 32P postlabeling assay. By means of the IARC-Classification, the DEREK-program and an epidemiologic literature screen we further divided the received 734 drugs and selected them representatively. After incubation of the pharmaceuticals with the rat liver slices in a submerged incubation system the DNA was isolated. The originated DNA-adducts were enriched, labeled with 32P and visualized with a thin layer chromatography-process. In this thesis we showed that the chosen test system which had been optimized to investigate DNA reactivity of steroidal compounds is able to detect DNA-adducts from various classes of pharmaceuticals. However, several drugs which were expected to cause adducts were surprisingly negative, namely alkylating antineoplastics like chlorambucil, cyclophosphamide and melphalan. Most probably the structural changes of the DNA bases caused by alkylation were too small to be chromatographically detectable. In addition we could show that the adduct-level and the specific adduct-pattern depends on several factors, for example age, gender, tissue and species, and the examination will be hindered due to I-compounds. However, the DNA-adduct analysis in tissue slices enabled an examination of different drugs and concentrations in one liver in only one in vitro experiment. Due to the fact that different tissues (in this thesis: liver and kidney) could be chosen, the efficiency and the significance of this method was broadened. Even the use of only small amount from substance is another benefit of this procedure. Although this procedure is very complex and time-consuming, the analysis could be chosen to clear up risk assessments from inconsistent combination of positive and negative results in carcinogenic and mutagenic experiments.