Charakterisierung der molekularen Marker BCL11b und IGFBP7 in der akuten T-lymphoblastischen Leukämie

Abstract

Akute T-lymphoblastische Leukämien (T-ALL) sind genetisch heterogene Erkrankungen, deren Überlebensrate in den letzten Jahrzehnten durch Therapieoptimierung zwar verbessert werden konnte, aber dennoch heute bei erwachsenen Patient_innen bei nur 30 bis 50 % liegt. Es ist daher notwendig die Auswirkung von für T-ALLs charakteristischer genetischer Aberrationen zu entschlüsseln und basierend auf diesen Erkenntnissen neue Therapien zu entwickeln, die spezifisch gegen leukämische Blasten wirken. In dieser Arbeit konnten zwei Kandidatengene genauer charakterisiert werden, die auf unterschiedlichem Wege jeweils T-ALL-Pathogenese und Progression beeinflussen. B-Cell CLL/Lymphoma 11B (BCL11b) ist ein essenzieller T-Zell- Transkriptionsfaktor. In dieser Arbeit wurde bei insgesamt 264 Patient_innen der German Multicenter Acute Lymphoblastic Leukemia Study Group (GMALL)-Kohorte und gesunden Kontrollpersonen die BCL11b-mRNA-Expression durch quantitative Real-Time PCR bestimmt. Es zeigte sich eine Assoziation einer niedrigen BCL11b-Expression mit einem unreifen Blasten-Immunphänotyp und einer geringeren Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit nach 5 Jahren (Ü) (BCL11b- niedrig: n = 40, 35 % Ü; BCL11b-hoch: n = 129, 53 % Ü; P = 0,02). Besonders ausgeprägt war dieser Zusammenhang bei Patient_innen der als Standardrisiko bewerteten thymischen T-ALL-Subgruppe (BCL11b-niedrig: n = 18, 20 % Ü; BCL11b- hoch: n = 84, 62 % Ü; P < 0,001). Zusätzlich wurde durch Sanger-Sequenzierung eine hohe Mutationsrate des Exon 4 von BCL11b bei T-ALL-Patient_innen gefunden (14 %). Diese Ergebnisse charakterisieren BCL11b als wichtigen prognostischen Faktor der T-ALL, der besonders bei thymischen T-ALL-Patient_innen ein niedrigere Überlebenswahrscheinlichkeit anzeigt und Indikation für eine intensivierte Therapie geben könnte. Im zweiten Teil der Arbeit wurde mit Insulin-like growth factor binding protein 7 (IGFBP7) ein Mitglied des Insulin-like growth factors (IGF)-Systems untersucht. Vor dem Hintergrund der Assoziation einer hohen IGFBP7-Expression mit Chemotherapie-resistenz bei T -ALL-Patient_innen wurde in der vorliegenden Arbeit die Auswirkung von Knockdown und Überexpression von IGFBP7 in Leukämiezelllinien untersucht. Eine Überexpression des Gens führte dabei in der T-ALL-Zelllinie Jurkat zu einer geringeren Proliferation. In den T-ALL-Zelllinien Molt-4 und Jurkat war ein größerer Anteil an IGFBP7-transfizierten Zellen in G0/G1-Arrest als kontrolltransfizierte Zellen. Zusätzlich induzierte IGFBP7-Überexpression in Jurkat-Zellen Resistenz gegenüber den Zytostatika Vincristin und Asparaginase. Sowohl die Oberflächenexpression als auch die Gesamtproteinmenge des IGF-1-Rezeptors (IGF1-R) war in IGFBP7-transfizierten Jurkat-Zellen reduziert und Behandlung mit dem IGF1-R-Inhibitor AEW541 konnte die IGFBP7-induzierte Resistenz gegenüber Vincristin aufheben. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse ein Modell zu IGFBP7-assoziiertem Therapieversagen in T-ALL- Patient_innen auf: Möglicherweise reduziert eine erhöhte Expression von IGFBP7 auf parakrinem oder autokrinen Weg IGF1-R-Signale. Dies resultiert in einem G0/G1-Arrest der Blasten, der mit einer Resistenz gegen bestimmte Zytostatika einhergeht. IGFBP7-Expression könnte daher als Biomarker fungieren, der auf mögliche Chemotherapieresistenzen hinweist, und eine Indikation für den Einsatz von IGF1-R-Inhibitoren darstellt.

Acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is a genetically heterogeneous disease and although its survival rate has increased during the last decades, it still remains only at 30 to 50 % in adult patients. Therefore it is necessary to decipher the consequences genetic aberrations characteristic for T-ALL and, based on these findings, develop new therapies, which specifically target leukemic blasts. This work was able to characterize two candidate genes, who influence the pathogenesis and progression of T-ALL through different pathways, respectively. B-Cell CLL/Lymphoma 11B (BCL11b) is an essential T-cell transcription factor.. In this study BCL11b mRNA expression was determined in 264 T-ALL patients of the German Multicenter Acute Lymphoblastic Leukemia Study Group (GMALL) cohort and healthy controls by qRT-PCR. Low BCL11b expression in T-ALL patients was associated with an immature blast immunophenotype and a lower 5-year overall survival (OS) (BCL11b-low: n = 40, 35 % OS; BCL11b-high: n = 129, 53 % OS; P = 0.02). This association was especially strong in the subgroup of thymic T-ALL patients, normally rated as standard risk (BCL11b-low: n = 18, 20 % OS; BCL11b-high: n = 84, 62 % OS; P < 0.001). Additionally Sanger sequencing identified a high mutation rate (14%) of BCL11b exon 4 in T-ALL patients. These results characterize BCL11b as an important prognostic factor in T-ALL which low expression indicates, especially in thymic T-ALL patients, a poor prognosis and could imply the need for therapy intensification. In the second part of this work the functional role of Insulin-like growth factor binding protein 7 (IGFBP7), a member of the Insulin-like growth factors (IGF) system was investigated. In light of the association of high IGFBP7 expression with chemotherapy resistance in T-ALL patients this study investigated the effect of a knockdown or an overexpression of IGFBP7 in human leukemic cell lines. Overexpression of the gene in the T-ALL cell line Jurkat resulted in reduced proliferation. In the T-ALL cell lines Molt-4 and Jurkat a larger percentage of IGFBP7-transfected cells were in G0/G1 arrest than control-transfected cells. IGFBP7 overexpression additionally induced resistance against the cytostatic drugs vincristine and asparaginase. Both surface expression and total protein abundance of the IGF-1 receptor (IGF1-R) was reduced in IGFBP7-transfected Jurkat cells and treatment with small molecule IGF1-R inhibitor AEW451 was able to abrogate the IGFBP7-induced resistance against vincristine. In summary these results illustrate a model of IGFBP7-associated therapy failure in T-ALL patients: an increased expression of IGFBP7 possibly reduces IGF1-R signalling in a paracine or autocrine manner. This in turn results in an increase of G0/G1 arrest in the leukemic blasts, which leads to their resistance against certain cystostatic drugs inactive in this cell cycle phase. High IGFBP7 expression could represent a biomarker for chemotherapy resistance and indicate treatment with IGF1-R inhibitors.