Validierung magnesiumsensitiver Gene als Biomarker für den intrazellulären Magnesiumstatus von Diabetes-mellitus-Typ-II-Patienten

Abstract

In einem Zellkulturversuch wurde die Expression magnesiumsensitiver Gene in Abhängigkeit von der extrazellulären Mg-Konzentration untersucht. Unter hypomagnesiämischen Bedingungen exprimierten Zellen der Linien JVM-13 und Jurkat die Gene SLC41A1, CNNM2, TRPM7, NIPA1 und N33 besonders stark. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass durch die Bestimmung der Expressionsraten dieser Gene Rückschlüsse hinsichtlich des intrazellulären Magnesiumstatus gezogen werden können. Das Gen CNNM2 wurde als möglicher Biomarker für ein Screening von Patienten mit Diabetes mellitus Typ II getestet. Die Expressionswerte des Gens wurden mit den korrespondierenden [Mg]Plasma- und [Mg2+]intra-Konzentrationen der Leukozyten in Beziehung gesetzt. Obwohl die [Mg]Plasma- Konzentration bei 114 von 115 Patienten im Normbereich lag, wurde bei etwa ¼ aller Patienten eine [Mg2+]intra-Konzentration unter 0,55 mmol/l nachgewiesen. Ein intrazelluläres Magnesiumdefizits korrelierte mit einer erhöhten Expression des Gens CNNM2. Die Ergebnisse des Patientenscreenings belegen, dass ein Magnesiummangel des Körpers durch die relative Expression des Gens CNNM2 zuverlässiger als durch die [Mg]Plasma- Konzentration detektiert wird. Wurden mit der [Mg]Plasma-Messung 96 % der defizienten Patienten nicht erkannt, waren es bei der Expressionswert-Bestimmung nur 14 %. Als magnesiumdefizient gilt ein [Mg2+]intra-Wert von unter 0,55mmol. Die tägliche Mg-Supplementierung von 300 mg über einen Monat normalisierte sowohl die Expression des Gens CNNM2 als auch die [Mg2+]intra-Konzentration. Letztere stieg im Mittel von 0,43 mmol/l auf 0,61 mmol/l signifikant an, während der mittlere [Mg]Plasma–Wert weiterhin im Normbereich lag. Die Bestimmung der Expression des magnesiumsensitiven Gens CNNM2 erlaubt die Identifizierung von Patienten, die ein intrazelluläres Defizit aufweisen und auf eine gezielte Mg- Supplementierung ansprechen. Aufgrund dessen kommt das Gen CNNM2 als ein möglicher Biomarker bei der Bestimmung des Magnesiumstatus des Körpers, insbesondere bei Diabetes mellitus Typ II, in Frage. Im Hinblick auf umfangreichere, zukünftige nationale sowie internationale Studien auf diesem Gebiet wurde das gesamte Versuchssetup anhand der MIQE-Richtlinien optimiert. Unter Verwendung der Analysesoftware „geNorm“ wurden die optimalen Housekeeping Gene HKGs) für Genexpressionsanalysen in JVM-13- und Jurkat- Zellen sowie humanen Leukozyten bestimmt. Hierbei wurde für JVM-13-Zellen B2M und YWHAZ, für Jurkat-Zellen B2M und TUBA1B und für humane Leukozyten B2M und ACTB als die stabilsten HKGs ermittelt. Die Normalisierung mit TUBA1B im Vergleich zu B2M und ACTB zeigte keine oder nur sehr geringe Abweichungen der GED-Werte der 20 Proben. Das HKG TUBA1B ist in Jurkat-, JVM-13-Zellen und humanen Leukozyten ein stabil exprimiertes Gen. Den Berechnungen der Expressionsdaten der vorliegenden Arbeit liegt somit eine zuverlässige Normalisierung zugrunde.

The expression of magnesium sensitive genes as a function of the extracellular magnesium concentration was investigated in a cell culture experiment. At low magnesium condition, cells of JVM-13 and Jurkat lines exhibited high expression of SLC41A1, CNNM2, TRPM7, NIPA1 and N33 genes. It was hypothesized, that with knowledge of the expression rate of these genes, one gains insight about the intracellular magnesium status. The capability of the CNNM2 gene as a biomarker was tested in a screening of patients diagnosed with diabetes mellitus type II. The expression levels of the gene were compared to the corresponding [Mg]plasma and [Mg2+]intra concentration of leukocytes. Although the [Mg]plasma concentrations of 114 from 115 patients were within normal range, about a quarter of all patients showed a low [Mg2+]intra concentration. However, an intracellular magnesium deficiency correlated with an increased expression of the CNNM2 gene. The results of the screening showed that a magnesium deficiency of the body is more reliably detected by the relative expression of the gene CNNM2 than by the [Mg]plasma concentration. An evaluation of the [Mg]plasma concentration failed to detect 96% of the patients determined to be deficient by intra-cellular measurement whereas determination by gene CNNM2 expression missed only 14%. The daily supplementation of 300 mg magnesium over the course of one month normalized both the gene CNNM2 expression and the [Mg2+]intra concentration. The average [Mg2+]intra concentration increased significantly from 0.43 mmol/l to 0.61 mmol/l while the mean of the [Mg]plasma value remained within the normal range. Determination of the expression of the magnesium sensitive gene CNNM2 enables the identification of patients with an intracellular deficiency and might respond to a purposeful magnesium supplementation. Therefore the CNNM2 gene is a promising biomarker of the magnesium status, especially in diabetes mellitus type II. To optimize the assay for extensive future studies in this field of research, the experiments were reviewed and the design improved according to the MIQE guidelines. The ideal housekeeping genes for an expression analysis in JVM-13 and Jurkat cells as well in leukocytes were determined using the analysis software „geNorm“. ● Expression rate analysis in JVM-13 cells was best normalized by YWHAZ. ● Expression rate analysis in Jurkat cells was best normalized by TUBA1B. ● Expression rate analysis in leukocytes was best normalized by ACTB. ● B2M was equally suitable as HKG for JVM-13 and Jurkat cells, as well as for human leukocytes. A comparison of the normalizations by B2M, ACTB and TUBA1B showed no or very small deviations of the GED values of 20 samples. The housekeeping gene TUBA1B used for normalization was a stably expressed gene in JVM-13 and Jurkat cells and human leukocytes. Therefore the calculations of the expression data in this thesis were based on a reliable normalization.