Histone methylation and neuroprotection in cerebral ischemia

Abstract

Cerebral ischemia leads to great transcriptional changes, primarily gene silencing. According to studies conducted in rodent models, stroke outcome can be improved by manipulating epigenetic players. Inhibition of transcriptional repressors on the level of DNA methylation and histone acetylation in ischemia leads to the maintenance of activating epigenetic marks, the restoration of the transcriptional balance and the attenuation of damage. At present, the role of histone methylation in this context is unexplored. As epigenetic players act in concert, we hypothesized that \- histone methylation is involved in ischemic damage development; \- the manipulation of enzymes on the level of histone methylation influences neuronal survival following ischemia; \- neuroprotection can be induced by inhibiting transcriptional repressors on the level of histone methylation, based on the transcriptional activation of protective genes. An in vitro model of stroke using rat primary cortical neurons subjected to oxygen glucose deprivation was employed, followed by cell survival analysis. First, the state of global histone methylation at selected methylation sites (histone 3 lysine 9 H3K9 and histone 3 lysine 4 H3K4) was examined post oxygen glucose deprivation. However, no recurring pattern was observed that clearly indicated gene repression, or highlighted a single methylation state (un-/mono-/di- or tri-methylated). Next, the expression of selected histone de-/methylating enzymes was analysed and manipulated. A marked upregulation of both mRNA and protein levels of the histone demethylase KDM3A was detected in hypoxic cortical neuron cultures. This effect was not observed for further candidate enzymes (SUV39H1, G9a, ESET and LSD1) and suggests an important role for KDM3A in hypoxia. Nevertheless, exogenous overexpression of the transcriptional activator KDM3A did not influence neuronal survival following experimental ischemia. Neither did the overexpression of transcriptional repressors (SUV39H1, LSD1), where an exacerbation of neuronal damage was expected upon hypoxic metabolic stress. In contrast, neuroprotection was successfully induced by inhibiting the transcriptional repressors LSD1, ESET, SUV39H1 and G9a with various pharmacological agents. SUV39H1 and G9a inhibitor Chaetocin was used in a neurological context for the first time and identified as novel neuroprotective agent. The histone demethylases SUV39H1 and G9a were chosen for closer analysis. Knockdown of both enzymes conferred protection to neurons in experimental stroke and confirmed the result achieved upon pharmacological inhibition. Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing revealed altered histone 3 (H3K9) modification states in promoter regions of certain genes upon SUV39H1 and G9a inhibition via Chaetocin. Activating promoter marks occurred together with elevated mRNA levels of the genes vascular endothelial growth factor (VEGF) and brain derived neurotrophic factor (BDNF). Further, BDNF blockade attenuated the protective effect of Chaetocin treatment, which distinguishes BDNF as a mediator of Chaetocin-induced neuroprotection. The findings of this thesis demonstrate that manipulating aberrant histone methylation upon experimental ischemia can alter cellular gene expression patterns and improve neuronal viability. As current treatment options in ischemia remain limited, the broadened understanding of epigenetic signalling and the identification of novel epigenetic neuroprotective agents and targets in histone methylation are promising and might potentially impact neuroprotective drug development.

Zerebrale Ischämie führt zu veränderter Genexpression, wobei es verstärkt zu einer Verminderung der Transkription kommt. Schlaganfallstudien an Nagetieren zeigen, dass eine ischämische Schädigung durch gezielte Manipulation epigenetischer Faktoren eingegrenzt werden kann. Die Inhibition transkriptioneller Repressoren, sowohl auf DNA-Methylierungs-Ebene als auch auf der Ebene der Histon-Acetylierung, kann zur Erhaltung aktivierender epigenetischer Faktoren führen und durch die Wiederherstellung der transkriptionellen Balance schadenseindämmend wirken. Bislang wurde die Rolle von Histon-Methylierung in diesem Zusammenhang wenig erforscht. Da epigenetische Faktoren interagieren, ergibt sich die Hypothese, dass \- Histon-Methylierung bei ischämischer Schadensentwicklung eine Rolle spielt; \- Neuroprotektion erreicht werden kann, indem transkriptionelle Repressoren auf Histon-Methylierungsebene inhibiert werden, was eine Aktivierung protektiver Gene erlaubt. Eingesetzt wurde ein in vitro Schlaganfallmodell, in dem primäre postmitotische Ratten-Neuronen einer Sauerstoff-Glukose-Deprivation unterzogen wurden. Anschließend folgten Untersuchungen zum zellulären Überleben. Untersucht wurden globale Histon-Methylierungsmuster an ausgewählten Positionen (Histon H3 Lysin 9 und Histon H3 Lysin 4) nach Sauerstoff-Glukose- Deprivation. Ausgeprägte Muster wurden hierbei allerdings nicht beobachtet. Des Weiteren wurde die Expression von Histon-Methyltransferasen und -Demethylasen analysiert und manipuliert. In hypoxischen Neuronen wurde die Demethylase KDM3A, im Unterschied zu anderen Enzym-Kandidaten (SUV39H1, G9a, ESET und LSD1), auf mRNA- und Protein-Ebene induziert. Die exogene Überexpression von KDM3A beeinflusste den neuronalen Schaden nach Sauerstoff- Glukose-Deprivation allerdings nicht. Die Überexpression zweier transkriptioneller Repressoren (SUV39H1, LSD1) blieb ebenfalls folgenlos. Im Gegensatz dazu führte die pharmakologische Inhibition der transkriptionellen Repressoren LSD1, ESET, SUV39H1 und G9a erfolgreich zu Neuroprotektion. Chaetocin, ein Suv39H1 und G9a Inhibitor, wurde zum ersten Mal in einem neurologischen Kontext eingesetzt und als neue neuroprotektive Substanz identifiziert. Auch der Knockdown der Histon-Methyltransferasen SUV39H1 und G9a führte bei experimentellem Schlaganfall zum Schutz von Neuronen. Nach Blockade von SUV39H1 und G9a mit Chaetocin konnten mittels Chromatin- Immunpräzipitation und Sequenzierung veränderte Histon H3 Lysin 9 Modifikationen in Promotorbereichen protektiver Gene nachgewiesen werden. Dabei wurde in den Genen des Vascular endothelial growth factor (VEGF) und des Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) neben epigenetischen Markern aktiver Genexpression ebenfalls erhöhte mRNA-Werte festgestellt. Außerdem schwächte die Blockade von BDNF den protektiven Effekt von Chaetocin auf Neuronen unter Sauerstoff-Glukose-Deprivation ab. BDNF wurde somit als wichtiger Vermittler von Chaetocin-induzierter Neuroprotektion in experimenteller Ischämie erkannt. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse die Hypothese, dass die Inhibition transkriptioneller Repressoren auf der epigenetischen Ebene der Histon- Methylierung erfolgreich zu Neuroprotektion führen kann. Durch die Inhibition repressiver Histon-Methyltransferasen wird die aktive Transkription wichtiger Mediatoren der Neuroprotektion, wie zum Beispiel BDNF, induziert. Die Wirkung epigenetischer Inhibitoren wie Chaetocin ist vielversprechend und könnte für eine erfolgreiche medikamentöse Schlaganfall-Therapie von Nutzen sein.