Functional Characterization of Naturally Occurring Mutants of the Human Guanine-rich RNA Sequence Binding Factor 1 (GRSF1) and Mechanistic Studies into the Molecular Basis of GRSF1-RNA Interaction

Abstract

GRSF1 is a ubiquitously occurring RNA-binding protein (RBP) that contains three quasi-RNA recognition motifs (qRRMs). These domains bind G-rich RNA sequences and the minimal RNA targeting sequence has been narrowed down to an A(G)4A sequence. Before this project the molecular mechanisms of GRSF1-RNA interaction and the functional consequences of naturally occurring mutations in human GRSF1 were not known. Here we expressed different human and mouse GRSF1 constructs, purified them to near electrophoretic homogeneity and employed these proteins for RNA-binding studies. GRSF1 frequently occurs in mammals but its distribution in other living organisms has not been studied in detail. Here we performed comprehensive in silico searches for GRSF1-like proteins and found that such sequences do not frequently occur in viral, bacterial, archaeal and fungal proteomes. However, related sequences were found in higher frequency in mosses, higher plants and lower non-mammalian animals. To explore the RNA-binding mechanism of GRSF1 we modified both, the RNA substrates and the RNA-binding protein. First, we analyzed RNA constructs representing GRSF1 substrates by circular dichroism spectroscopy and found that these oligonucleotides fold into parallel G-quadruplex secondary structures. Next, we functionally characterized the different structural domains of GRSF1 and determined their binding constants with a labeled RNA probe representing the 5’-UTR of human GPx4 mRNA. Our results indicate that the N-terminal Ala-rich domain is not essential for RNA-binding. In contrast, the three canonical RNA-binding domains contribute to high affinity RNA- binding. Finally, we functionally characterized naturally occurring genetic variations of human GRSF1. For this purpose we first modeled the 3D structure of the qRRM domains on the basis of the NMR structure of hnRNP F and identified putative RNA interacting amino acids. The models indicated that the qRRM domains adopt the canonical β1α1β2β3α2β4-fold, which is characteristic for RNA-binding proteins. To explore the genetic variability of human GRSF1 we searched different genomic databases and found a total of 294 genetic variations. However, except for the S95P exchange none of them has an allele frequency >1%. Exploring the functional consequences of selected non- synonymous nucleotide exchanges we found that the following mutants exhibited impaired RNA-binding capabilities: Q155R and T162S in qRRM1, T318C and F322S in qRRM2, T468C and F472L in qRRM3. To investigate the molecular basis for this impairment we created a number of additional GRSF1 mutants and observed that chemistry and geometry of critical amino acid site chains impact the RNA- binding behavior of human GRSF1. To exclude that our mutations have altered the global structure of GRSF1 we performed thermal shift assays and found that the naturally occurring mutations did neither impact the global protein structure nor protein stability.

GRSF1 ist ein ubiquitär vorkommendes RNA-bindendes Protein (RBP), das drei quasi-RNA-Erkennungsmotive (qRRMs) enthält. Diese Domänen binden G-reiche RNA- Sequenzen und die minimale RNA-Zielsequenz wurde auf das A(G)4A-Sequenzmotiv eingeengt. Vor Beginn dieses Projektes waren die molekularen Mechanismen der GRSF1-RNA-Wechselwirkungen und die funktionellen Konsequenzen von natürlich vorkommenden Mutationen im humanen GRSF1-Gen nicht bekannt. Um diese Themen zu erforschen, haben wir zunächst verschiedene humane und murine GRSF1-Konstrukte als rekombinante Proteine exprimiert und weitgehend aufgereinigt. Diese Proteine wurden anschließend für mechanistische Untersuchungen zur RNA- Bindungsfähigkeit eingesetzt. Um die Evolution von GRSF1 zu erforschen, haben wir öffentlich zugängige Sequenzdatenbanken nach GRSF1-ähnlichen Sequenzen durchsucht. Dabei konnten wir festgestellen, dass solche Proteine in viralen, pro-karyotischen und Pilzproteomen wenig verbreitet sind. Im Gegensatz dazu kommen GRSF1-ähnliche Sequenzen in Moosen, höheren Pflanzen und bei niederen Tieren weiter verbreitet vor. Um den RNA-Bindungsmechanismus von GRSF1 besser zu verstehen, haben wir sowohl die RNA Substrate als auch das Bindungsprotein (GRSF1) zielgerichtet modifiziert. Zuerst wurden dabei Messungen des Zirkulardichroismus an potentiellen GRSF1 Substraten durchgeführt. Aus diesen Daten wurde geschlussfolgert, dass GRSF1 Substrate sich in parallele G-quadruplex Strukturen falten, die als Erkennungsstrukturen dienen. Anschließend wurde die funktionelle Bedeutung der verschiedenen GRSF1 Domänen untersucht. Die Ala-reiche Domäne hat für die RNA Bindung kaum Bedeutung. Demgegenüber tragen alle drei qRRM Domänen zur hochaffinen RNA-Bindung bei. Um die funktionellen Auswirkungen natürlich vorkommender Mutationen im humanen GRSF1 Gen analysiert. Dafür wurden zuerst 3D-Strukturmodelle für die drei RNA- Bindungsdomänen des humanen GRSF1 erstellt. Diese Modellierungen ergaben, dass sich die GRSF1 qRRMs in das klassische β1α1β2β3α2β4-Motiv falten, welches charakteristisch für RNA bindende Proteine ist. Bei unserer Suche nach natürlich vorkommenden Mutationen im humanen GRSF1 Gens identifizierten wir einen SNP (single nucleotide polymorphism) und knapp 300 seltenen Mutationen. Von diesen wiesen die folgenden Aminosäureaustausche funktionelle Defizite auf: Q155R, T162S in qRRM1, T318C, F322S in qRRM2 und T468C, F472L in qRRM3. Mechanistische Untersuchungen lassen darauf schließen, dass die Chemie und die Geometrie kritischer Aminosäureseitenketten für die RNA-Bindungsfähigkeit bedeutsam sind. Vergleichende Fluoreszenzmessungen zeigten, dass alle hergestellten GRSF1 Mutanten keine gravierenden strukturellen Unterschiede zum Wildtypenzym aufwiesen.