Hochpolymorphe molekulargenetische Marker in der Transplantationsimmunologie, Anthropologie und Forensik

Abstract

Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeiten wurden Methoden zur Analyse hochpolymorpher HLA- und STR-Marker entwickelt und ihre Anwendung in den verschiedenen Bereichen der Transplantationsimmunologie, Anthropologie und Forensik studiert. Der kritischste Punkt der PCR-basierten forensischen Analyse aber auch der Chimärismus-Analyse im Niedrigzellbereich ist die DNS- Isolation selbst. In umfangreichen Studien wurde insbesondere die Probenvorbereitung optimiert und ein standardisiertes Lyse-Protokoll für nahezu alle biologischen Materialien kreiert. Nach Optimierung und Validierung wurde die automatische, auf Magnetpartikeln basierende DNS-Extraktion bei mehr als 50.000 Routineproben eingesetzt. Es gab keinen Hinweis auf Kontamination oder Anwesenheit eines PCR-Inhibitors. Bereits aus drei kernhaltigen Zellen konnte ein STR-Profil erstellt werden. Eine mögliche weitere Reduzierung der Nachweisgrenze des DNS-Analyseverfahrens führte zur Gesamtgenom-Amplifikation. Die Nachweisgrenze zur Erlangung eines vollständigen STR-Profils lag bei 100 pg. Unterhalb dieser DNS-Menge wurden heterozygote Imbalancen, Imbalancen zwischen den Loci, Allelverluste sowie zusätzliche Allele detektiert. Schon frühe Studien zur Einführung der HLA-Marker in die forensische Spurenanalyse ergaben eine hohe Sensitivität der verwendeten PCR-Systeme auch für degradierte DNS. Die neu etablierte Methodik der Kurzstreckensequenzierung mittels PyrosequencingTM für HLA-Marker ist besonders für den Hochdurchsatz geeignet. So können genetische Risikofaktoren komplexer Erkrankungen, die HLA- Typisierungen großer Kohorten notwendig machen, hochauflösend analysiert werden. Die physikalische Separation von HLA-Allelen ermöglichte die Extraktion einer sehr langen Sequenzregion eines Allels mit den jeweiligen Exon- und Intronabschnitten. Zwei neue HLA-B Allele konnten ohne den sonst für den Nachweis neuer Allele vorgeschriebenen Klonierungsschritt erstmals eindeutig detektiert werden. Obwohl die STR-Analyse nicht prospektiv zwischen gesunden Leukozyten des Empfängers oder Zellen des beginnenden leukämischen Rezidivs unterscheiden kann, haben die Ergebnisse zum zellartspezifischen Chimärismus-Monitoring nach Stammzelltransplantation deutlich gemacht, dass persistierende oder wiedererscheinende Empfängerzellen ein nahendes Rezidiv bereits weit vor dem klinischen Befund anzeigen. Immunmodulierende Therapien konnten gut dokumentiert werden. Das Phänomen der persistierenden Spender- Zellen im peripheren Blut noch Jahre nach orthotoper Lebertransplantation (OLT) konnte eindeutig nachgewiesen werden. Der beschriebene, klinische Fall einer akuten myeloischen Leukämie nach OLT, war der erste Bericht, der eine transplantatlokalisierte, spenderspezifische Leukämie demonstrierte, diagnostiziert durch STR-Analysen. Die Anwendung der HLA- und STR-Marker in der Populationsgenetik, am Beispiel der Besiedlungsgeschichte des Pazifik, hat ein sehr komplexes Bild gezeichnet und gezeigt, dass fundierte Darlegungen über Weg, Zeit und Raum von Völkerwanderungen nur das Ergebnis linguistischer, archäologischer, anthropologischer und molekulargenetischer Untersuchungen sein kann. Die ermittelten genetischen Daten unter Einsatz völlig unterschiedlich mutierender Systeme und unterschiedlichen Vererbungslinien gaben Aufschluss über die Geschichte von Populationen, die das heutige Erscheinungsbild der Pazifikbewohner geformt haben.

In the presented professorial dissertation methods have been developed to analyse high polymorphic HLA- and STR-markers. Furthermore down stream applications in the fields of transplantation immunology, anthropology and forensic have been studied. The most critical stage in PCR-based forensic analysis as well as in chimerism analysis of low copy cell regions is DNA isolation, which should yield as much highly purified DNA as possible. Our work focuses mainly on sample preparation, obtaining the maximum possible amount of biological material, and the following cell lysis, to create a simple standardized protocol suitable for nearly all biological material. After optimization and validation, the automatic DNA extraction method based on magnetic particles has been used for more than 50,000 routine samples. There has been no evidence of cross contamination or the presence of PCR inhibitors. Samples of the resulting DNA as small as 20 pg yield reliable complete STR amplification profiles. Further experiments to reduce the detection limit lead to the Whole Genome DNA Amplification (WGA) a promising method to generate large amounts of DNA from samples of limited quantity. With only 100 pg WGA template a profile could be established that may be considered error-free. But we detected unbalanced STR amplifications at a locus and between loci, allelic “drop-out’s” and additional alleles after WGA of low copy number DNA. Whole genome amplification could not reveal new horizons of STR analyses in low copy cell regions as is the case in forensic evidence as well as in chimerism monitoring of limited cell populations after stem cell transplantation. Early studies of HLA marker in forensic case work have already shown a high sensitivity of the used PCR system even for degraded DNA. The new established method of a short-range sequencing system using PyrosequencingTM for HLA-marker is especially suited for high-throughput. The approach was optimised and practically tested for genotyping in disease association studies. Our well-elaborated PyrosequencingTM-based protocols offered a new alternative to the existing HLA typing methods and represented a convenient and economic solution, a unique combination of high accuracy with high sample throughput. Haplotype specific extraction (HSE) allows the collection of individual alleles by separating diploid samples into their haploid components. Consequently, very long sequence regions of separate alleles, including exon and intron stretches for a specific locus, are available for further typing strategies. Novel polymorphisms in HLA-B alleles were clearly analysed after the alleles were separated by HSE, allowing new alleles to be easily detected without cloning. Repeated chimerism analysis of leukocyte subpopulations after allogeneic stem cell transplantation detected impending relapse before clinical diagnosis. Although chimerism analysis cannot distinguish prospectively between residual healthy leucocytes of the recipient or incipient leukaemia relapse, the data show that persistent or reappearing recipient cells indicate impending relapse. The phenomenon of persistence of donor cells in peripheral blood even for years after orthotopic liver transplantation (OLT), called microchimerism, could be clearly demonstrated. The described clinical case with unusual extramedullary presentation of an allograft-derived acute myeloid leukaemia after OLT was the first report demonstrating allograft-localised donor-derived leukaemia, diagnosed by STR analysis.