Erzeugung und Charakterisierung genetischer Impfstoffe gegen konservierte Proteine von Influenza A

Abstract

DNA-Impfstoffe können, per Gene Gun verabreicht, vergleichsweise hohe Zahlen an zytotoxischen T-Lymphozyten induzieren. Im Gegensatz zu gespaltenen oder inaktivierten Viren kann mit konservierten CTL-Epitopen eine breitere Immunität gegen mehrere Virusstämme vermittelt werden. Im Verlauf dieser Arbeit wurden die Gene HA, M1, M2 und NP von Influenza (A/Vietnam/1194/2004, H5N1-clade 1) in Codon-optimierter und Wildtyp-Variante erzeugt und in das Plasmid pTH ligiert. Die Plasmid-Präparationen wurden auf ihren Gehalt an Lipopolysacchariden hin untersucht. Nach einer Überprüfung der Expression in Zellkulturen wurden Mäuse per Gene Gun mit den DNA-Konstrukten in Kombinationen mit Plasmiden von Immunomodulatoren geimpft. Als Immunomodulatoren wurden Plasmide von GM-CSF, IL-12 und IL-21 in Kombinationen appliziert. Impfreaktionen wurden im ELISpot und ELISA untersucht. Unter den von Influenza abgeleiteten, untersuchten Peptiden war das Peptid NP366-374 immunodominant in C57Bl/6-Mäusen. Über 80% der immunisierten Mäuse hatten im ELISpot > 1600 Spots / Million Splenozyten gegen dieses Epitop. Der aus den vier Influenzagenen bestehende, GM-CSF-verstärkte Impfstoff wurde für Belastungsstudien mit verschiedenen Influenzastämmen eingesetzt und vermittelte über 80% Schutz gegen bis zu 50 MLD50 eines aus einer anderen H5N1-Untergruppe stammenden Virus (A/Germany/R65/2006, H5N1-clade 2.2), nicht aber gegen 5 MLD50 eines H1N1-Stamms (A/PuertoRico/8/1934). Dieser Schutz basierte hauptsächlich auf dem Gen des Nucleoproteins (NP) und in geringerem Umfang auf dem Hämagglutinin. Eine Aminosäuresubstitution an der variablen Position 373 des in der zytotoxischen Immunantwort von Mäusen immunodominanten NP366-74-Peptids im Belastungsstamm führte wahrscheinlich zum kompletten Verlust des NP-basierten Impfschutzes.

When applied with a Gene Gun, DNA vaccines are able to induce a relatively strong cytotoxic T-cell response. Immunity against a wider range of virus strains may therefore be achieved compared to that induced using split viruses or inactivated viruses. In this study, the HA, M1, M2 and NP genes of influenza (A/Vietnam/1194/2004, H5N1-clade 1) were produced in both wild-type and codon-optimised forms and ligated into the plasmid pTH. Plasmid preparations were tested with regard to their lipopolysaccharide content. After confirming protein expression in cell culture, mice were immunised with the DNA constructs via Gene Gun together with immunomodulatory plasmids (GM- CSF, IL-12 and IL-21) in different combinations. The resulting immune reactions were analysed by ELISpot and ELISA. Of the peptides tested, NP366-374 was found to be immunodominant in C57Bl/6 mice, with over 80% of the immunized mice developing epitope-specific T-cell frequencies of 1600 or more per million splenocytes in the ELISpot. The protective efficacy of a vaccine containing plasmids coding for four influenza genes plus GM-CSF was evaluated by challenging immunised mice with pathogenic influenza virus. Over 80% of mice could be protected against challenge with up to 50 MLD50 of a virus belonging to a different H5N1 clade (A/Germany/R65/2006, H5N1-clade 2.2), but not against 5 MLD50 of an H1N1 strain (A/PuertoRico/8/1934). This protection relied predominantly on responses to the nucleoprotein (NP) gene and to a lesser extent to those specific for hemagglutinin. An amino acid substitution at the variable position 373 in the immunodominant peptide NP366-74 for cytotoxic T-cells appeared to abrogate the NP-based protection.