CD22-gerichtete Therapie inhibiert die Signaltransduktion und den Ca2+-Fluss in humanen B-Lymphozyten

Abstract

Hintergrund: CD22 ist ein Transmembranprotein, welches ausschließlich auf B-Zellen exprimiert wird, Adhäsion und Migration reguliert und zelluläre Immunantworten als Folge der B-Zell-Rezeptor (BCR)-Stimulierung inhibiert. Nach BCR-Stimulation werden die Spleen-Tyrosinkinase (Syk), sowie Phopholipase C (PLC-γ2) aktiviert und intrazelluär Ca2+ freigesetzt. Epratuzumab ist ein humanisierter, monoklonaler anti-CD22 Antikörper. Er befindet sich aktuell in klinischen Studien in der Therapie beim systemischen Lupus erythematodes. Zielsetzung: Ziel war es, einen möglichen Einfluss von Epratuzumab auf die BCR-Signalweiterleitung nachzuweisen. Methoden: Der Effekt von Epratuzumab auf die BCR-induzierte Signalweiterleitung wurde in vitro anhand von Phosphorylierungsanalysen der BCR-Signalmoleküle Syk und PLC-γ2 und Analysen des intrazellulären Ca2+-Flusses bestimmt. Der Einfluss von Epratuzumab auf die Phosphorylierung von Syk und PLC-γ2 wurde in vitro durchflusszytometrisch an mononukleären Zellen des peripheren Blutes von gesunden Spendern untersucht. Um die Konzentration von intrazellulärem Ca2+ zu bestimmen wurden mit Indo-1 AM behandelte B-Zellen mit oder ohne F(ab`)2-Epratuzumab inkubiert und anschließend mit F(ab`)2 anti IgM/IgG stimuliert. Intrazelluläre Ca2+-Konzentrationen wurden über einen Zeitraum von 10 Minuten durchflusszytometrisch bestimmt. Ergebnisse: Epratuzumab reduzierte die Phosphorylierung von Syk und PLC-γ2 unter in vitro BCR-Stimulierung. Die Inhibition der Kinase-Phosphorylierung konnte in CD27- naiven und CD27+-Gedächtnis-B-Zellen gezeigt werden und scheint unabhängig von der Signalweiterleitung durch Fc-Rezeptoren zu sein, da ein Epratuzumab F(ab`)2-Fragment vergleichbare Ergebnisse zeigte wie der komplette Antikörper. Außerdem wurde durch die Zugabe des Epratuzumab F(ab`)2-Fragmentes der durch den BCR induzierte Ca2+-Fluss reduziert. Schlussfolgerung: Diese Daten stehen in Übereinstimmung mit der Möglichkeit, den Schwellenwert der BCR-Aktivierung durch die Blockierung von CD22 anzuheben und somit eine Überaktivierung dieser Zellen bei Autoimmunerkrankungen besser kontrollieren zu können.

Background: CD22 is a surface molecule exclusively expressed on B lymphocytes involved in adhesion and B-cell receptor (BCR) signaling. By recruiting a tyrosine-phosphatase to its intracellular tail it acts as an inhibitory co- receptor of the BCR via dephosphorylation of signaling molecules, such as spleen tyrosine kinase (Syk). Phosphorylation of Syk is essential upon BCR engagement and upstream of BCR-triggered Ca2+ flux. Epratuzumab, a humanized anti-CD22 monoclonal antibody is currently being investigated in clinical trials of SLE patients. Although it has been recently published that the antibody affects B-cell proliferation as well as the expression of adhesion molecules and B-cell migration, its potential impact on intracellular signaling events needs to be delineated. Therefore, the current study investigated the influence of epratuzumab on downstream kinases and BCR- induced Ca2+ flux on human B cells. Methods: The in vitro effects of epratuzumab on BCR-induced Ca2+ signaling were evaluated by Ca2+ flux assays. Purified B cells were pre-incubated with F(ab’)2-epratuzumab or medium only and were subsequently stimulated with anti-F(ab’)2 IgM and IgG. Intracellular Ca2+ concentrations were monitored by flow cytometry over 10 minutes after activation. Subsequently, the influence of epratuzumab on the phosphorylation of the BCR signaling molecules Syk and PLC-γ2 linked to Ca2+ flux were studied in vitro. Results: BCR-activation induced an initial peak of Ca2+ flux that occurred within the first 10 seconds which was moderately increased by epratuzumab. Notably, pre-incubation of epratuzumab strongly reduced Ca2+ flux in B cells after the initial period compared to controls treated with medium only which exhibited increased Ca2+ during sustained BCR-triggering. At corresponding time points of the Ca2+ monitoring, phosphorylation status of Syk and PLC-γ2 after BCR-stimulation was measured. Pre-treatment with epratuzumab as well as its F(ab')2-fragments led to a substantial reduction of the phosphorylation of Syk and of PLC-γ2 upon BCR stimulation as compared to controls after 8 minutes. These differences in Syk and PLC-γ2 were not found during the initial Ca2+-peak at 10 seconds as well as at 1 minute consistent with the notion that they were not yet fully activated. Notably, effects on the phosphorylation of Syk and PLC-γ2 were observed in CD27- naïve and CD27+ memory B cells. Conclusion: The data support that epratuzumab is able to exert inhibitory effects on BCR signaling by a sustained reduction of Ca2+ flux and reduction of Syk and PLC-γ2 phosphorylation upon BCR engagement consistent with a potential that CD22 targeting may reduce the characteristic B-cell hyperreactivity in SLE.