Role of inflammatory cells in cerebral ischemia

Abstract

Myeloid cells are key effector cells in cerebral ischemia. Peripheral macrophages and neutrophils infiltrate from the periphery into the brain parenchyma thereby passing the blood brain barrier that is regulated by pericytes. Resident microglia get activated and enhance attraction of peripheral immune cells. Whether subsequent neuroinflammation is harmful or neuroprotective is unclear. Post-stroke immunodepression leads to apoptosis of lymphocytes and myelocytes causing secondary infections entailing clinical post-stroke complications and mortality. To better understand the role of innate immune cells in neurological disorders we generated a mouse lacking Ikk2 specifically in myeloid cells. To this aim, mice expressing Cre recombinase (Cre) under the control of the Lysozyme M (LysM) promoter were crossed with mice carrying two loxP-flanked (floxed) Ikk2 alleles. We characterized the resulting LysM-Cre Ikk2fl/fl mouse in vitro for cell- specific deletion of the Ikk2 gene. Thereby we confirmed decreased Ikk2 mRNA and protein levels in microglia and macrophage cultures in comparison to those of littermates, which do not express Cre, and with astroglial cultures, which derive from the neuroectoderm. Analysis of these cell cultures for nuclear translocation of the NF-κB subunit p65 and the secretion of pro-inflammatory molecules like TNF-α, nitric oxide and IL-6 in response to LPS stimulation implicated inhibition of the NF-κB signaling pathway in LysM-Cre Ikk2fl/fl microglia. Cultured LysM-Cre Ikk2fl/fl microglia showed reduced vitality compared to control cells with a switch to apoptosis due to Ikk2 disruption. In macrophages viability and cytokine secretion seemed to be unaffected suggesting a switch to an alternative phenotype. In vivo characterization of the LysM-Cre Ikk2fl/fl mouse revealed the development of splenomegaly accompanied by enhanced expression of inflammatory markers and neutrophilia. Furthermore we explored the general feasibility of administration of peripheral immunocompetent cells by transplantation of splenocytes into mice after MCAo, which failed to affect post-stroke immunodepression and infarct volume. Since pericytes/mural cells at the blood brain barrier may modulate infiltration of inflammatory cells into the CNS, we investigated the fate of pericytes after MCAo, detecting both apoptosis and proliferation.

Myeloidzellen spielen eine Schlüsselrolle beim ischämischen Schlaganfall. Einerseits wandern Makrophagen und Neutrophile von der Peripherie in das Gehirnparenchym ein, wobei sie die Blut-Hirn-Schranke passieren, welche durch Perizyten reguliert wird. Andererseits werden im Gehirn residente Mikroglia aktiviert, die wiederum periphere Immunzellen rekrutieren. Ob die derart entstehende Neuroinflammation für das Zentrale Nervensystem (ZNS) schädlich oder protektiv ist, ist derzeit noch unklar. Nach zerebraler Ischämie kommt es darüber hinaus zu einer peripheren Immundepression, die zu Apoptose von Lymphozyten und myeloiden Zellen führt. In der Folge kann es zu Sekundärinfektionen kommen, die klinische Komplikationen und den Tod nach sich ziehen können. Um die Rolle des angeborenen Immunsystems in neurologischen Krankheiten besser verstehen zu können, generierten wir eine Maus, der das Ikk2-Gen spezifisch in Myeloidzellen fehlt. Zu diesem Zweck kreuzten wir eine Maus, welche die Cre-Rekombinase (Cre) unter der Kontrolle des Lysozym M-Promoters (LysM) exprimiert, mit einer anderen Maus, deren beide Ikk2-Allele von loxP-Sequenzen flankiert (floxed) sind. Die resultierende LysM-Cre Ikk2fl /fl-Maus charakterisierten wir in vitro um die zellspezifische Deletion des Ikk2-Gens zu prüfen. Im Zuge dessen belegten wir, dass IKK2 auf mRNA- und Proteinebene in kultivierten Mikroglia und Makrophagen vermindert produziert wird. Als Kontrolle dienten Mikroglia und Makrophagen aus Mäusen, die kein Cre tragen, sowie Astrozytenkulturen aus LysM-Cre Ikk2fl/fl-Mäusen, die dem Neuroektoderm entstammen. Wir überprüften die Kerntranslokation der NF-κB- Untereinheit p65 in diesen Kulturen, sowie die Sekretion von proinflammatorischen Molekülen wie TNF-α, Stickoxid und IL-6 nach Stimulation mit LPS. Tatsächlich war die NF-κB Signalkaskade in LysM-Cre Ikk2fl/fl- Mikroglia gehemmt. Weiters zeigten kultivierte LysM-Cre Ikk2fl/fl-Mikroglia erhöhte Mortalität aufgrund der Ikk2-Deletion. In Makrophagen hingegen waren Vitalität und Zytokinsekretion unverändert, was einen Übergang zu einem alternativen Phenotyp bedeuten könnte. Darüber hinaus entdeckten wir, dass LysM-Cre Ikk2fl/fl-Mäuse teils stark vergrößerte Milzen hatten. Genauere Untersuchungen dokumentierten in diesem Zusammenhang erhöhte Werte von Endzündungsmarkern sowie Neutrophilie in der Milz. In einem weiteren Ansatz verabreichten wir Wildtyp-Mäusen nach zerebraler Ischämie periphere immunkompetente Zellen. Hierfür transplantierten wir Milzzellen in Mäuse, bei denen kurz davor eine MCAo durchgeführt worden war. In diesem Szenario waren weder Effekte auf die periphere Immundepression noch auf das Infarktvolumen zu beobachten. Ebenfalls nach MCAo untersuchten wir das Schicksal der Perizyten, die an der Blut-Hirn-Schranke sitzen, und möglicherweise Einfluss auf die Einwanderung von Immunzellen ins ZNS haben. Wir detektierten sowohl vermehrte Apoptose als auch erhöhte Proliferation in dieser Zellpopulation.