Synaptotagmin I: Palmitoylierung und intrazelluläre Prozessierung

Abstract

Die Palmitoylierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, bei der Palmitinsäurereste (C16:0) über Cysteine kovalent an Polypeptidketten gebunden werden. Diese Art der Modifikation wurde bereits bei einer Vielzahl zellulärer und viraler Proteine beschrieben, allerdings konnten bisher nicht alle strukturellen und funktionellen Aspekte dieser Fettsäureanlagerung geklärt werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Voraussetzungen für die Bindung der Fettsäuren an die Cysteinreste des vesikulären Membranproteins Synaptotagmin I zu untersuchen. Außerdem sollte geklärt werden, welche Auswirkungen das Fehlen der Fettsäurereste auf die intrazelluläre Prozessierung und die Funktion des Proteins hat. Zur Klärung dieser Fragestellungen wurden Mutanten des Synaptotagmin-Gens erzeugt und mittels Vaccinia-T7-System bzw. durch Transfektion mit kationischen Lipiden (Lipofektin) in verschiedenen Zellkulturen exprimiert. Die Charakterisierung der exprimierten Proteine erfolgte entweder durch metabolische Markierung mit Radionukliden oder durch die Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:

A) Alle fünf in der Acylierungsregion von Synaptotagmin I vorhandenen Cysteinreste sind direkt oder indirekt an der Palmitoylierung beteiligt. Nur die Mutante, bei der alle fünf Cysteine durch Serine ersetzt wurden (Syt mut), zeigte in CV1-Zellen keinen metabolischen Einbau von (3)H-markierter Palmitinsäure. Die selektive Löschung einzelner Cysteinreste senkte die Einbaurate von (3)H-Palmitinsäure auf jeweils etwa 40% des Wildtyp-Proteins.

B) In CV1- und BON-Zellen zeigte das exprimierte Synaptotagmin I ein charakteristisches Glykosylierungsmuster. Mittels Pulse-Chase-Experimenten konnte gezeigt werden, daß erst nach etwa 2 Stunden die hochglykosylierte und vermutlich physiologisch aktive Form des Proteins in den exprimierenden Zellen vorliegt. Bei der fettsäurefreien Mutante erfolgt dieser Reifungsvorgang bedeutend langsamer. Auch nach zweistündiger Inkubationszeit nach der metabolischen Markierung wird der hochglykosylierte Zustand des Proteins nicht erreicht.

C) Zellfraktionierungsexperimente an BON-Zellen bestätigten, daß der Transport des synthetisierten Proteins innerhalb der Zelle durch die fehlende Palmitoylierung bzw. indirekte Effekte der substituierten Cysteinreste beeinträchtigt ist. Allerdings erbrachten fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Transportvorgänge von Wildtyp und fettsäurefreier Mutante in differenzierten PC12-Zellen nach Langzeitexpression keine Unterschiede in der zellulären Lokalisation. Bei beiden Formen des Proteins erscheint die Zielsteuerung in die Axonenden normal.

Die Ergebnisse zeigen, daß die kovalent an die Polypeptidkette von Synaptotagmin I gebundenen Fettsäurereste wichtig sind für bestimmte intrazelluläre Transportabschnitte von der Synthese des Proteins bis zu seinem Wirkungsort an den synaptischen Vesikeln, auch wenn durch Unterbindung der Acylierung keine komplette Transportblockade erfolgt. Eine exakte Funktion dieser Modifikation konnte allerdings noch nicht ermittelt werden.

Palmitoylation is a post translational modification of proteins which binds palmitic acid molecules (C16:0) covalently via cycteine residues to the polypeptide chain. This kind of modification has been reported for many viral and cellular proteins but structural and functional aspects of this fatty acid attachment could not be completely clarified yet. The aim of this work was to examine the molecular requirements for the binding of palmitic acid to cystein residues of the vesicular membrane protein synaptotagmin I. The consequences of the loss of these fatty acids for intracellular processing and function of this protein were also investigated. To resolve these questions mutants of the synaptotagmin I gene which lack either one or more cystein within their putative palmitoylation region were constructed. These constructs were expressed in several cell lines using the vaccinia T7 system or by transfection with cationic lipids (lipofectin). The expressed proteins were characterized either by metabolic labelling or by detection with antibodies coupled with a fluorescence dye. The results can be summarized as follows:

A) All five cysteins within the palmitoylation region of synaptotagmin I are either directly or indirectly involved in the attachment of palmitic acid. Only the total mutant in which all cysteins were substituted by serines showed no incorporation of (3)H-labelled palmitic acid. A selective substitution of certain cysteines to serins reduced the rate of incorporation to about 40% of the rate found for wild type synaptotagmin.

B) In CV1 and BON cells the expressed synaptotagmin showed a characteristic pattern of glycosylation products. Pulse chase experiments revealed that the highly glycosylated and presumably physiologically active form of the protein does not appear in the cells until two hours after labelling. The fatty acid free mutant showed a significantly retarded maturation. Even after two hour of incubation the mutant does not reach the highly glycosylated form.

C) Cell fractionation experiments confirmed that the lack of palmitoylation and/or the substitution of the cysteins affected the transport of the newly synthesized protein. In differentiated PC12 cells fluorescence microscopic investigation of transport of the wild-type protein and the fatty acid free mutant resulted in no differences in intracellular localisation after long term expression. The targeting of both expression products to the axon terminals seemed normal.

The results of the experiments show that fatty acids covalently attached to the polypeptide chain of synaptotagmin I are important for certain steps in the transport pathway of the protein although no complete block of transport events occured if acylation was prevented. No distinct function of this modification was found yet.