Vergleich dreier Pulsfeld-Gelelektrophorese-Protokolle zur Typisierung von Clostridium perfringens-Isolaten

Abstract

Die AAD ist eine nosokomiale Infektion, die bei stationären Patienten zu verlängertem Krankenhausaufenthalt, zusätzlichen diagnostischen und therapeutischen Maßnahmen und erhöhten Kosten für das Gesundheitswesen führt. Als Haupterreger der AAD gelten das Bakterium Clostridium difficile und seit den 80er Jahren auch das Bakterium Clostridium perfringens. C. perfringens ist weltweit als Erreger bei Lebensmittelintoxikationen bekannt. 2-5% aller C. perfringens-Isolate produzieren ein Enterotoxin (CPE), das auch in Stuhlproben von Patienten mit AAD gefunden wurde. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Pulsfeld-Gelelektrophorese als molekulare Typisierungsmethode zu etablieren, um enterotoxinpositive und enterotoxinnegative C. perfringens-Stämme zu differenzieren und anhand der damit gewonnenen Ergebnisse klonale Zusammenhänge aufzudecken. Die verwendeten C. perfringens-Isolate stammen aus Stuhlproben von Patienten des CBF der Charité - Universitätsmedizin Berlin, bei denen der Verdacht auf eine AAD bestand. Zur Etablierung eines geeigneten PFGE-Protokolls wurden im Rahmen der Arbeit drei Protokolle von unterschiedlichen Laboren (Ludwig-Maximilians-Universität München, Pittsburgh Universität, Charité Berlin) verglichen und anschließend in Anlehnung an Literaturangaben modifiziert. Trotz der Verwendung etablierter Protokolle und der Adaptation zahlreicher Modifikationen konnten C. perfringens-Isolate mittels PFGE nicht erfolgreich typisiert werden. Die Degradation der C. perfringens-DNS durch Endonukleasen, nicht vollständige Zelllysis oder Proteinverdauung sowie eine spezielle Art der bakteriellen Aufbereitung wurden als mögliche Ursachen diskutiert. Um die genaue Ursache der mangelnden Typisierbarkeit festzustellen, sind weitergehende Untersuchungen erforderlich. Alternativ können neue PCR-basierte Verfahren eingesetzt werden. Zur Aufklärung der Epidemiologie der AAD ist es dringend notwendig, weiterhin C. perfringens-Isolate auf molekularer Ebene zu typisieren, da die AAD eine der häufigsten nosokomialen Infektionen darstellt und die Prävention der Infektion ein wichtiges Instrument der Krankenhaushygiene ist.

AAD is a nosocomial infection which leads to extended hospital stay of stationary patients, additional diagnostic and therapeutic measures, and thus increased costs for the public health service. The most commonly accepted pathogen of AAD is C. difficile. Since the 1980s, C. perfringens, known as pathogen of food-borne illness, is also discussed in the context of AAD. Two to five percent of all C. perfringens isolates found in stool samples of patients infected by AAD produce an enterotoxin (CPE). The aim of this study was to establish the pulse-field gel electrophoresis as a molecular technique to differentiate enterotoxin positive and -negative C. perfringens strains and to clarify their clonal relationships. C. perfringens isolates used in the present study were isolated from stool samples of hospitalized patients of the CBF (Charité-Universitätsmedizin Berlin) with a putative diagnosis of AAD. In order to establish a PFGE protocol three existing protocols kindly provided by different laboratories were compared and modified. Despite numerous modifications C. perfringens could not be successfully typed by PFGE. As potential causes, the degradation of C. perfringens DNS by endonucleases, incomplete cell lysis and/or protein digestion as well as specific techniques for preparation of bacterial DNS are discussed. Further research is required in order to identify and evaluate the exact cause of unsuccessful typing. The typing of C. perfringens isolates on molecular level is essential to clarify the epidemiology of AAD. Due to the fact that AAD is one of the most frequent nosocomial infections prevention is an important tool for hospital hygiene.