Proteomeanalysis of plants

Abstract

Within the course of this PhD thesis twodimensional gelelectrophoresis and MALDI-TOF-MS based methods have been evaluated and developed to fulfil the aim of large scale plant proteomics. Particular attention was paid to the optimisation of proteinextraction, proteinseparation and proteinstaining. In this context a new fractionation based proteinextraction method which gave rise to an 300 % increased display of proteinspots on 2-DE gels could be established. On the basis of the developed techniques we were able to establish a set of 2-DE standardpatterns from 8 different Arabidopsis thaliana tissues. Apart from the optimisation of 2-DE techniques an improved, robust and automated MALDI sample preparation system could be established. The set up of these methods allows the analysis and handling of more than 1000 proteinspots from 2-DE gels per day. In a following step the combination of the 2-DE-and the MALDI protocols will be employed for the large scale identification of a vast portion of the Arabidopsis thaliana proteome. As a primary step it was possible in a set of proof of principle experiments to identify 681 proteinspots from two different Arabidopsis thaliana leaf fraction 2-DE gels. Further we identified 352 proteinspots from an Arabidopsis thaliana silique 2-DE gel. In total the number of these preliminary identified proteins exceeds by far the number of previous published 2-DE proteomic data from Arabidopsis thaliana. In a second proof of principle experiment it was possible to show the increased separation capabilities of 2-DE gels. In this example the identification of differentially expressed proteins from water starved cucumber plants was achieved. This experiment clearly showed the need of two-dimensional separation of proteins from complex mixtures to display differentially expressed proteins, since one-dimensional protein separation is not sufficient to fulfil this task. In a last example the combination of tissue prefractionation techniques with 2-DE and MALDI-MS was used to identify an Arabidopsis thaliana subproteome. In this case the purification of cytosolic 80S ribosomal proteins was achieved by sucrose gradient density centrifugation of Arabidopsis thaliana leaf tissue. In this experiment it was possible to identify a large part (70 %) of the expected protein components of plants cytosolic ribosome from a single gel in a single round of identification. In total a number of 224 proteinspots could be identified from this ribosomal sample.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Techniken ebenso wie Methoden evaluiert und entwickelt, die basierend auf der Verwendung von zweidimensionaler Gelelektrophorese und MALDI-TOF-MS Proteomanalysen von pflanzlichen Geweben ermöglichen. Hierbei wurden zunächst optimierte Methoden für die Proteinextraktion, Proteintrennung und die Proteinfärbung für die 2-DE erarbeitet. So konnte z. B. eine neue fraktionierte Gesamtproteinextraktionsmethode für Pflanzengewebe entwickelt werden, die eine bis zu 300 % verbesserte Ausbeute an Proteinspots auf 2-DE-Gelen im Vergleich zu Standardextraktionsmethoden zulässt. Diese optimierten Methoden wurden in einem weiterführenden Schritt für die Herstellung von 2-DE-Standardmustern aus 8 unterschiedlichen Arabidopsis thaliana-Geweben eingesetzt. Neben der Methodenentwicklung im 2-DE-Bereich wurden im Bereich der MALDI- Probenpräparation und der MALDI-Analyse stabile und automatisierte Protokolle für die Identifikation von 2-DE-Gel-getrennten Proteinen etabliert. Diese Protokolle ermöglichen es, mehr als 1000 Proteinspots pro Tag massenspektrometrisch zu analysieren. Um die reelle Anwendbarkeit und Tauglichkeit der entwickelten Methoden zu dokumentieren, wurden anhand dreier charakteristischer pflanzenspezifischer Fragestellungen Beispielexperimente durchgeführt. So ließen sich in einem ersten Ansatz 681 Proteinspots aus 2 unterschiedlichen Arabidopsis thaliana-Blattproteinextrakten und 352 Proteinspots aus einem Arabidopsis thaliana-Schotenproteinextrakt identifizieren. Die hierbei identifizierten Proteine, die aus nur 3 2-DE-Gelen stammten, übersteigen in ihrer Summe bereits alle bis dato publizierten Daten im Bereich der Arabidopsis thaliana-2-DE-basierten Proteomforschung. In einem zweiten Anwendungsexperiment wurden differentiell regulierte Phloemproteine aus trockengestressten Gurkenpflanzen in 2-DE-Gelen dargestellt und identifiziert. Hierbei zeigte sich, dass diese Art der differentiellen Analyse komplexerer Proteinmischungen das Auflösungsvermögen von herkömmlichen eindimensionalen Trennsystemen übersteigt und somit fast ausschließlich mittels zweidimensionalen Trennsystemen durchgeführt werden sollte. In einem letzten Anwendungsbeispiel, dessen Fokus auf der Analyse des cytosolischen 80S Ribosoms aus Arabidopsis thaliana-Blättern lag, konnte durch die Kombination einer Gewebsvorfraktionierung und der 2-DE ein Großteil (70 %) der bekannten Komponenten des cytosolischen Ribosoms bestimmt werden. Insgesamt ließen sich hierbei 224 Proteinspots aus einem einzigen 2-DE-Gel identifizieren.