dc.contributor.author
Fogelström, Ewelina
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:32:39Z
dc.date.available
2013-04-02T12:02:18.430Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5145
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9344
dc.description.abstract
Platinum complexes are frequently employed in the therapy of several cancers
such as testicular- and ovarian cancer. The first therapeutically used
platinum complex, cisplatin, has been the subject of extensive research since
its therapeutic potential was discovered in the Sixties. Ever since, a vast
number of chemical modifications have been exploited with the aim to reduce
the side effects and enhance cytotoxicity. New platinum complexes are often
tested in cancer culture cells to evaluate their cytotoxic potential. To
further characterize the complexes, other investigations such as whole cell
uptake and subcellular distribution are often conducted e.g. amount in cell
nuclei and/or binding to DNA. In the present work, emphasis has been given to
the investigation of the subcellular distribution of four platinum complexes,
cisplatin, m4FPtCl2, dl4FPtCl2 and mDAH4FPtCl (two platinum atoms). In
previous works, these complexes have displayed differences regarding
cytotoxicity, whole cell- and nuclei accumulation and binding to genomic DNA.
To further investigate their subcellular distribution, different
centrifugation methods were used in the present work to collect subcellular
fractions from HeLa cells where flameless atomic absorption spectrometry was
employed for the quantification of platinum. Moreover, the cross-resistance
and whole cell associated platinum in MCF-7 cells with acquired resistance was
investigated. The differences in subcellular distribution between the platinum
complexes were small after 2 h of incubation and this was true for the
recovered percentage in each fraction as well as for the protein normalized
amounts. The highest platinum amount was found in the cell nuclei fraction (~
10-25 % depending on the complex) but the differences in protein normalized
amounts between the fractions were relatively small. It is suspected that the
density gradient is too crude to differentiate between complexes with small
differences in their subcellular distribution. The results from the western
blot analysis of the subcellular fractions from the density gradient indicate
that the peroxisomes might be damaged. Cryo-electron microscopy of the
fractions led to the assumption that the integrity of the mitochondria is
assaulted. It is believed that a gentler sample preparation method would
better preserve organelle integrity and therefore increase gradient separation
efficiency. Since the cell entry mechanism might affect the subcellular
distribution, the role of three fluid-phase endocytosis mechanisms in whole
cell accumulation of cisplatin, m4FPtCl2 and mDAH4FPtCl were investigated.
Inhibitors of macropinocytosis and clathrin- and caveolin dependent
endocytosis did not lower the cell associated platinum amounts for any of the
tested complexes. The subcellular distribution of the enzyme horseradish
peroxidase (HRP) was different than for the platinum complexes (uptake in
nuclei and plasma membrane fractions was not investigated) and a higher
accumulation in fractions containing the lysosomal marker protein LAMP1 was
seen. However, the results from the subcellular fractionation can only be used
to show that the distribution is different for the enzyme than for the
platinum complexes because of presumed lysosomal breakdown of HRP. The uptake
of HRP was lowered by inhibitors of macropinocytosis and clathrin-dependent
endocytosis. Thus, different cell accumulation mechanisms of the platinum
complexes and the protein HRP might partly explain differences in subcellular
distribution. Subsequent purification of the mitochondrial DNA after
incubation of HeLa cells with the complexes, revealed all complexes to be
associated with the DNA. If the whole cell accumulation data is considered,
cisplatin is more efficiently bound to HeLa cell DNA compared to the other
complexes. MCF-7 cells were cultivated in the presence of cisplatin, m4FPtCl2
and dl4FPtCl2 to acquire resistance. MCF-7 cells with resistance to cisplatin
were not resistant to m4FPtCl2 or dl4FPtCl2. However, m4FPtCl2 displayed cross
resistance to dl4FPtCl2 in cells tolerant against dl4FPtCl2. Whole cell
associated platinum was lowered for cisplatin in cisplatin resistant cells. No
obvious differences in cell uptake were seen for m4FPtCl2 and dl4FPtCl2 in any
of the tolerant cell lines. It is postulated that the uptake of these
complexes is not playing an important role in the resistance mechanisms but
more experiments are required to confirm this.
de
dc.description.abstract
Platinkomplexe haben eine wichtige Position in der heutigen Krebstherapie.
Hoden- und Ovarialkrebs können damit erfolgreich behandelt werden. Cisplatin
ist der erste therapeutisch verwendete Platinkomplex. Seit dem Entdecken
seiner biologischen Wirkung in den sechziger Jahren, ist ein erhebliches
Forschungsfeld im Gang gesetzt werden im welchen ein Vielzahl von chemischen
Modifizierungen von Cisplatin untersucht worden sind. Das Ziel ist einen neuen
Komplex mit erhöhter Zytotoxizität und weniger Nebenwirkungen zu finden. Um
ihre Zytotoxizität zu bewerten, werden neue Platinkomplexe häufig in
Zellkulturen von Krebszellen getestet. Weitere Methoden um der Interaktion
zwischen biologisches Material und Platinkomplexe zu charakterisieren, sind
Untersuchungen wie Zellaufnahme und subzelluläre Distribution wie z.B.
Platinmengen assoziiert mit der Zellkern und/oder Bindung des Platins am
Erbgut. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt an den Untersuchungen der
subzellulären Distribution von den Platinkomplexen cisplatin, m4FPtCl2,
dl4FPtCl2 und mDAH4FPtCl (zwei Platinatome). Vorherige Arbeiten haben gezeigt
dass die Komplexe Unterschiede bezüglich Zytotoxizität, Assoziation mit
Zellen, Zellnuklei und Bindung an der Zellulären DNA aufweisen. Um weitere
Informationen über die subzelluläre Distribution der Komplexe zu erhalten,
sind in der jetzigen Arbeit verschiedene Zentrifugierungsmethoden benutzt
worden um subzelluläre Fraktionen von HeLa Zellen zu erhalten in welchen
Platin mittels Atomabsorptionsspektrometrie quantifiziert worden sind. Die
Unterschiede in subzellulärer Distribution zwischen den Platinkomplexen nach 2
Std Inkubationszeit waren klein. Dies galt für Prozentuale- sowie auf Protein
normalisierten Platinmengen. Die höchsten Platinmengen sind in die
Zellnukleifraktion gefunden worden (~ 10-25 % je nach Komplex) aber die
Unterschiede zwischen Fraktionen mit auf Protein normalisierte Platinmengen
waren relativ klein. Es wird vermutet dass der Densitätsgradient nicht fein
genug ist um niedrige Unterschiede in subzellulären Verteilung zwischen
Komplexe bemerkbar zu machen. Die Lage des peroxisomalen Markerprotein im
Densitätsgradient lässt die Vermutung nahe, dass die Peroxisomen beschädigt
sind. Cryo-elektronmikroskopische Analyse der Fraktionen weist darauf hin dass
die Mitochondrien als nicht intakt vorliegen. Eine schonende
Probenaufarbeitung wurde mutmaßlich die Organellenintegrität besser erhalten
und infolgedessen den Abscheidegrad des Gradients erhöhen. Der
Zellaufnahmemechanismus kann die subzelluläre Distribution beeinflussen und
deswegen wurden drei Endozytosehemmer eingesetzt. Weder Hemmsubstanzen der
Makropinozytose oder Hemmsubstanzen der klathrin- und kaveolinabhängige
Endozytose konnte die Zellaufnahme von cisplatin, m4FPtCl2 oder mDAH4FPtCl
beeinflussen. Das Enzym Meerettichperoxidase (HRP) unterschied sich von den
Platinkomplexen in seiner subzellulären Distribution und höhere Anreicherung
konnte in Fraktionen, die das lysosomale Markerprotein LAMP1 enthalten,
gesehen werden. Dennoch können diese Ergebnisse nur benutzt werden um einen
Unterschied zwischen Protein und Komplexe festzustellen. Wegen vermuteter
lysosomaler Verdauung des Enzyms sind andere Aussagen ausgeschlossen. Die
Zellaufnahme von HRP konnte durch Hemmung der Makropinozytose und der
klathrinabhängige Endozytose erniedrigt werden. Demzufolge kann die
unterschiedliche intrazelluläre Distribution von den Platinkomplexen und das
Protein zumindest Teils von unterschiedlichen Zellaufnahmemechanismen erklärt
werden. Quantifizierung des Platins in aufgereinigter mitochondrialer DNS nach
Inkubation von HeLa-Zellen mit den Komplexen zeigte dass alle Komplexe mit der
DNS assoziiert sind. Vorherigen Arbeiten haben markante Unterschiede in
Zellakkumulierung zwischen den Komplexen in MCF-7 Zellen nach 24 Std
festgestellt und cisplatin ist in Hinsicht auf die totale Platinmenge in den
Zellen, am effektivsten an DNS gebunden. MCF-7 Zellen wurden entweder mit
cisplatin, m4FPtCl2 oder dl4FPtCl2 kultiviert um Resistenz zu entwickeln. Die
cisplatinresistente Zellen waren nicht resistent gegen m4FPtCl2 oder
dl4FPtCl2. Allerdings zeigten m4FPtCl2 gewisse Kreuzresistenz gegen dl4FPtCl2
in Zellen mit Resistenz gegen dl4FPtCl2. Platinmengen waren niedriger in
cisplatinresistente Zellen als in Kontrollzellen nach Inkubation mit
cisplatin. Dementsprechend galt nicht für m4FPtCl2 oder dl4FPtCl2 in deren
respektive resistenten Zelllinien. Es wird vermutet dass der Aufnahmeweg für
diese Komplexe nicht mit in den Resistenzmechanismus mit beteiligt ist obwohl
mehrere Experimente sind nötig um dies zu befestigen.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
subcellular distribution
dc.subject
platinum complexes
dc.subject
atomic absorption spectrometry
dc.subject
density gradient
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::615 Pharmakologie, Therapeutik
dc.title
Subcellular distribution of platinum complexes
dc.contributor.firstReferee
Prof.Dr.Ronald Gust
dc.contributor.furtherReferee
Prof.Dr.Gerhard Wolber
dc.date.accepted
2013-02-14
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000093822-0
dc.title.translated
Subzelluläre Distribution von Platinumkomplexen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000093822
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000013107
dcterms.accessRights.dnb
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open access