Untersuchungen zur Neurotoxizität endogen gebildeter Substanzen und Verbesserung der Schutzmechanismen

Abstract

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass endogen gebildete Neurotoxine an der Entstehung einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer- Krankheit oder Parkinson-Krankheit beteiligt sein können. Mehrere Studien bestätigten, dass zu den Faktoren, die das Absterben der neuronalen Zellen begünstigen, zählen oxidativer Stress, mitochondriale Dysfunktion und Abnahme der antioxidativen Kapazität der Zelle. QUIN, KYNA und 3-HK, Metaboliten des Kynureninwegs und Salsolinol, ein Dopamin-Derivat werden mit mehreren Krankheiten des zentralen Nervensystems assoziiert. Als eine viel versprechende Therapiemöglichkeit gegen Neurodegeneration wird der Einsatz von Flavonoiden und anderen polyphenolischen Verbindungen pflanzlicher Herkunft aufgrund der antioxidativen Eigenschaften in vitro betrachtet. Um Neurotoxizität oder Neuroprotektion gegenüber Kynurenin-Metaboliten zu untersuchen, werden in der neurobiologischen Forschung aufwendige Primärzellen-Modelle genutzt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es ein einfaches, schnelles und genaues in-vitro Zellmodell aus menschlichen SK-N-SH- und SH-SY5Y-Neuroblastomzellen durch Behandlung mit verschiedenen Differenzierungsfaktoren zu etablieren. Als die Anfälligkeit einer Zelle verändernde Faktoren wurden in der vorliegenden Arbeit Differenzierungsfaktoren, wie TNF-α und RA sowie Modulierung des Stoffwechselvorgangs durch den Ersatz von Glukose durch Galaktose im Zellkulturmedium verwendet. Die Ergebnisse der erfassten Studie weisen darauf hin, dass zwar eine Differenzierung der beiden Zelllinien mit RA zur Entwicklung des neuronalen Phänotyps führte, aber die Zellempfindlichkeit nach der Behandlung mit Neurotoxinen, Salsolinol und 6-OHDA sowie 3-HK im Vergleich zu unbehandelten Zellen niedriger war. Die Zellvitalität blieb weiterhin nach der Zugabe von QUIN und KYNA unverändert. Interessanterweise wurden die gleichen Beobachtungen bei den im Galaktose-Medium wachsenden Zellen gemacht. Um einen möglichen therapeutischen Einsatz bei Alzheimer- und Parkinson- Patienten wissenschaftlich begründen zu können, wurden einige Polyphenole, Natriumpyruvat und GSH auf die schützenden Effekte gegen die durch Neurotransmitter-Metaboliten induzierte Neurotoxizität bei humanen SH-SY5Y- Neuroblastomzellen mittels MTT-Tests und ATP-Lumineszenz-Assays untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass Luteolin vor der 6-OHDA- und 3-HK- vermittelten Reduktion der Zellvitalität schützte und dass zu den daran beteiligten Schutzmechanismen Erhöhung des ATP-Gehaltes, Abnahme der Caspase-3/7-Aktivität und Überexpression des Bcl-2-Proteins gehören. Allerdings war Luteolin nicht in der Lage, einen Schutz vor dem durch Salsolinol-induzierten Zelltod zu liefern. Weder eine Vorinkubation mit anderen Polyphenolen, noch eine gleichzeitige Inkubation konnten die neurotoxischen Effekte von Neurotransmitter-Metaboliten in SH-SY5Y-Zellen unterdrücken. Interessant scheint die Tatsache, dass sowohl eine Vorinkubation als auch eine Koinkubation mit Natriumpyruvat vor 6-OHDA, Salsolinol und 3-HK- induzierter Apoptose schützen konnte. Zudem war der durch Natriumpyruvat vermittelte Neuroprotektion signifikant größer als die von Luteolin, was die Ergebnisse des Caspase-3/7-Assays und des Bcl-2 ELISA zeigten. Eine Kombination von Luteolin und Natriumpyruvat war in der Lage, einen besseren Schutz zu liefern als die Behandlung mit einzelnen Substanzen. Die protektiven Eigenschaften von Luteolin und Natriumpyruvat gegenüber 6-OHDA- und 3-HK- Zytotoxizität in SH-SY5Y-Zellen weisen auf verschiedene Wirkmechanismen und die Eigenschaften hin, die das Eindringen der Substanzen in die Zelle erlauben. In der vorliegenden Studie wurde auch beobachtet, dass GSH den durch 3-HK- und 6-OHDA-ausgelösten Zelltod und die Abnahme des ATP-Gehaltes reduziert. Allerdings konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass eine Inkubation von Salsolinol und GSH in Konzentrationen unter 250 μM zur Erhöhung der Apoptoserate in SH-SY5Y-Zellen führte. Die Behandlung mit GSH über 250 μM lieferte einen Schutz vor Salsolinol-induziertem Zelltod. Ferner konnte mittels HPLC-Analyse beobachtet werden, dass eine Inkubation von Salsolinol und GSH in Konzentrationen unter 250 μM zur Entstehung neuer Verbindungen führt, vermutlich Salsolinol-Derivate, die toxischer als Salsolinol sind. Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse lässt sich sagen, dass Salsolinol in Anwesenheit von GSH in den Konzentrationen unter 250 μM an der Entstehung der Neurodegeneration beteiligt sein kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit können einen Beitrag zur Pathophysiologie der neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. Parkinson-Krankheit leisten.

There is increasing evidence that endogenously produced toxins may be involved in the development of a number of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease or Parkinson’s disease and that the mechanisms leading to cell loss are a combination of oxidative stress, mitochondrial dysfunction and decrease in antioxidant defenses. Quinolinic acid (QUIN), kynurenine acid (KYNA) and 3-hydroxykynurenine (3-HK), metabolites of the kynurenine pathway and salsolinol, a derivate of dopamine are thought to be associated with many central nervous system diseases. As a promising neuroprotective strategy against neurodegeneration the use of flavonoids and other polyphenolic compounds synthesised by plants is considered, due to antioxidative properties in vitro. However, in neuroscience research in order to test neurotoxicity or neuroprotection against kynurenine-metabolites only primary cell models are available. In this investigation we aimed to develop a simple, rapid and accurate cellular in vitro model using immortalized human neuroblastoma cell lines, namely SK-N-SH and SH-SY5Y differentiated by treatment with various agents. In order to alter the cell response to the neurotoxins, tumor necrosis factor-alpha and retinoic acid as differentiating agents and modulation of the cellular metabolism through changing the sugar composition from glucose to galactose in media were used. Our results indicated that although retinoic acid-differentiation of both cell lines induced the expression of neuronal features, cell vulnerability after exposure to control neurotoxicants, salsolinol, 6-hydroxydopamine (6-OHDA) and 3-HK was decreased in compare to untreated cells and was not influenced after exposure to QUIN and KYNA. Interestingly, the same observations were done in the cells grown in galactose media. In order to find a possible therapeutic application to neurodegenerative disorders, we investigated protective effects of some polyphenols, sodium pyruvate and glutathione on 6-OHDA, salsolinol and 3-HK induced neurotoxicity in obtained cellular model system, human neuroblastoma SH-SY5Y cells. We found that luteolin prevented from 6-OHDA and 3-HK induced cell viability reduction and that mechanisms involved in the neuroprotective process include the ability to increase the level of cellular adenosine-5’triphosphate (ATP), decrease caspase-3/7 activity and upregulate Bcl-2 expression. However, luteolin was ineffective against salsolinol-induced toxicity in MTT and ATP-luminescence assay. Neither pre-treatment with flavonoids nor simultaneous addition had any protective effects in the 6-OHDA, salsolinol or 3-HK induced neurotoxicity. Interestingly, both pre-treatment and co-treatment with sodium pyruvate provided protection against 6-OHDA, salsolinol or 3-HK induced apoptosis. Moreover, decrease of caspase-3/7 activity and ability to elevate Bcl-2 levels by sodium pyruvate was found to be more significant than that of luteolin. The ability of luteolin and sodium pyruvate to reduce toxicity of 6-OHDA and 3-HK in SH-SY5Y cells may be related to many different neuroprotective mechanisms and the capability to penetrate into the cell. In this study, we also demonstrated that glutathione inhibits cell death and ATP-depletion caused by 3-HK and 6-OHDA. However, unexpectedly salsolinol neurotoxicity toward SH-SY5Y cells was potentiated during treatment with concentrations of glutathione below 250 μM, whereas glutathione concentrations above 250 μM resulted in protection against salsolinol induced neuronal cell death. We also report that the incubation of salsolinol and low concentrations of glutathione led to increased apoptosis. We also report that the incubation of salsolinol and low concentrations of glutathione leads to formation of novel compounds, probably salsolinol derivates, which are more toxic than salsolinol. Hence, salsolinol in the presence of low glutathione concentration may be involved in neurodegeneration. These data may provide new promising insights into the pathophysiology of neurodegenerative disorders such as Parkinson’s disease.