dc.contributor.author
Schönrath, Katharina
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:32:24Z
dc.date.available
2010-01-13T07:35:18.527Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5130
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9329
dc.description
Abkürzungsverzeichnis V 1 Zusammenfassung/Abstract 1 2 Einführung in die
Thematik 3 2.1 Charakteristik maligner Tumorerkrankungen 3 2.1.1 Tumorgenese 3
2.1.2 Metastasierung und Metastasierungssuppressoren 4 2.1.3 Signalkaskaden
mit Einfluss auf die Tumorprogression 8 2.1.3.1 Signalwege der Botenstoffe
cAMP und cGMP 8 2.1.3.2 Tyrosinkinaserezeptoren und nachgeschaltete
Signalkaskaden 9 2.1.3.3 Signaltransduktion des TGF-Signals 12 2.2 Das
neuronale Kalziumsensorprotein VILIP-1 12 2.2.1 Intrazelluläre neuronale
Kalziumsensoren (NCS) 12 2.2.2 Visinin-like protein 1 (VILIP-1) 17 2.2.2.1
Allgemeine Charakterisierung von VILIP-1 17 2.2.2.2 VILIP-1 als
Tumorinvasionssuppressor 20 2.3 Fragestellung 21 3 Material und Methoden 22
3.1 Material 22 3.1.1 Allgemeine Chemikalien und Verbrauchsmittel 22 3.1.2
Allgemeine Materialien für die Zellkultur 23 3.1.3 Effektoren und Inhibitoren
24 3.1.4 Antikörper 24 3.1.5 Oligonukleotide und Vektoren 26 3.1.6
Zellkulturmodell 27 3.2 Methoden 28 3.2.1 Kultivierung der Tumorzelllinien 28
3.2.2 Transiente Transfektion 28 3.2.3 Bestimmung der intrazellulären cAMP
bzw. cGMP Konzentration 29 3.2.4 Zell-Matrix-Adhäsionstest 29 3.2.5 Zell-
Dissoziationsmessung 30 3.2.6 In-vitro-Analyse der Zell-Migration 30 3.2.7
Immunzytochemie und Fluoreszenzintensitätsmessung 31 3.2.8 Western Blot
Analyse 32 3.2.9 Reverse-Transkriptase-PCR und Agarosegelelektrophorese 34
3.2.10 Bioinformatische Promotoranalyse 35 3.2.11 Statistische Analyse 35 4
Ergebnisse 36 4.1 Modulation der VILIP-1-Expression 36 4.2 Bedeutung cAMP- und
cGMP-abhängiger Signalwege für das Metastasierungspotential von SCC-Zellen 37
4.2.1 Messung der Konzentration intrazellulärer zyklischer Nukleotide 37 4.2.2
Analyse der Zell-Matrixadhäsion 39 4.2.3 Modulation des
Dissoziationsverhaltens der SCC-Zellen 40 4.2.4 Untersuchung des
Migrationsverhaltens der SCC-Zellen 41 4.2.5 Dissoziation in Abhängigkeit von
VILIP-1 43 4.2.6 Migrationsvermögen in Abhängigkeit von VILIP-1 45 4.2.7
Analyse der Expression der partikulären Guanylatzyklasen 46 4.2.8 Analyse des
Expression der Adenylatzyklase-Isoformen 47 4.2.9 Subzelluläre Lokalisierung
der Adenylatzyklasen 49 4.3 Untersuchungen zur Rolle von VILIP-1 bei der
Tumorprogression 51 4.3.1 Profil der Hauttumorzelllinien 51 4.3.2 Auswirkungen
der Stimulation mit den Wachstumsfaktoren TGF-ß und EGF 52 4.3.3 Regulation
der Expression von Integrin 5 und E-Cadherin 53 4.3.4 Regulation der
Expression des Transkriptionsfaktors snail-1 55 4.3.5 Dissoziationsverhalten
der SCC-Zellen nach EGF-Stimulation 58 4.3.6 Auswirkungen der EGF-Stimulation
in Migrationsanalysen 60 4.3.7 Beeinflussung des Migrationsverhaltens durch
Kinaseinhibitoren 61 5 Diskussion 63 5.1 Bedeutung cAMP- und cGMP-abhängiger
Signalwege für das Metastasierungspotential von SCC-Zellen 63 5.1.1 Messung
der Konzentration intrazellulärer zyklischer Nukleotide 63 5.1.2 Zelladhäsion,
-dissoziation und -migration in Abhängigkeit vom intrazellulären cAMP-
beziehungsweise cGMP-Spiegel 64 5.1.3 Zelldissoziation und -migration in
Abhängigkeit von VILIP-1 67 5.1.4 Expression der partikulären Guanylatzyklasen
68 5.1.5 Expression und Lokalisierung der Adenylatzyklase-Isoformen 69 5.1.6
Fazit 71 5.2 Untersuchungen zur Rolle von VILIP-1 bei der Tumorprogression 74
5.2.1 Profil der Hauttumorzelllinien 74 5.2.2 Stimulation mit den
Wachstumsfaktoren TGF-ß und EGF 75 5.2.3 Regulation der Expression von
Integrin 5 und E-Cadherin 76 5.2.4 Regulation der Expression des
Transkriptionsfaktors snail-1 79 5.2.5 Zelldissoziation und -migration nach
EGF-Stimulation 81 5.2.6 Signalwege bei der Regulation der Zellmigration 83
5.2.7 Fazit 84 5.3 Ausblick 87 6 Literaturverzeichnis 89 7 Verzeichnis der
erfolgten Publikationen VI 8 Lebenslauf VII 9 Anhang VIII
dc.description.abstract
Visinin-like-Protein 1 (VILIP-1), ein Vertreter der neuronalen
Kalziumsensorproteine, wirkt in murinen Plattenepithelkarzinomzellen (SCC-
Zellen) der Haut als Tumorinvasionssuppressor, indem es die Zell-
Matrixadhäsion und die Zellinvasion inhibiert. Bei Ösophagustumoren und nicht-
kleinzelligen Lungentumoren ließ sich des Weiteren eine Korrelation zwischen
dem Verlust der Expression von VILIP-1 und der Überlebensrate/Prognose zeigen.
Die anti-invasive Wirkung ging mit einer reduzierten RhoA- und
MMP-9-Aktivität, sowie mit einer verminderten Expression von
Fibronektinrezeptoren einher und konnte auf einen erhöhten cAMP-Spiegel in
VILIP-1-positiven, weniger aggressiven SCC-Zellen zurückgeführt werden. Im
Nervensystem wurde VILIP-1 hingegen vor allem als Modulator der zytosolischen
cGMP-Konzentration beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde daher im
Zellkulturmodell aus zwei aggressiven Plattenepithelkarzinom-Zelllinien der
Haut ohne VILIP-1-Expression und zwei weniger aggressiven,
VILIP-1-exprimierenden Zelllinien untersucht, ob der Einfluss von VILIP-1 auf
das Metastasierungspotential der Tumorzellen ausschließlich über cAMP-
Signalwege oder auch durch die Modulation der cGMP-Signalgebung durch VILIP-1
vermittelt wird. Es konnte gezeigt werden, dass in aggressiven,
VILIP-1-negativen SCC-Zellen ein erhöhter cGMP-Spiegel nach Stimulation der
partikulären Guanylatzyklasen NPR-A und NPR-B vorliegt. Die erhöhte cGMP-
Konzentration und die resultierende Zunahme der Zellmigration der SCC-Zellen
ließen sich auf ein höheres, jedoch von VILIP-1 unabhängiges Expressionsniveau
von NPR-A und NPR-B zurückführen. Der durch VILIP-1 bedingte, erhöhte basale
cAMP-Spiegel in weniger aggressiven, VILIP-1-positiven SCC-Zellen reduzierte
die Zell-Matrixadhäsion sowie die Migration und basierte interessanterweise
auf der verstärkten Oberflächenexpression von Adenylatzyklasen, entsprechend
des Effekts von VILIP-1 auf die Oberflächenexpression von NPR-B und dem nAChR
in Neuronen. Darüber hinaus wurde analysiert, welche extrazellulären Signale
und welche intrazellulären Signalmoleküle an der Regulation der Expression von
VILIP-1 während der Tumorprogression beteiligt sind. Die chronische
Stimulation mit EGF induzierte bei den VILIP-1-exprimierenden Zellen die
epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und führte neben der Herabsetzung der
Expression von E-Cadherin auch zum Verlust der VILIP-1-Expression. Im
Unterschied zur Expression von Integrin 5, wurde die Expression von
E-Cadherin nicht durch VILIP-1 reguliert. Dagegen ließ sich die Expression des
Transkriptionsrepressor snail-1, der in VILIP-1 negativen SCC-Zellen
exprimiert wurde und dessen Expression in VILIP-1-postiven SCC-Zellen durch
EGF-Stimulation induziert werden konnte, sowohl durch VILIP-1 als auch durch
Erhöhung des cAMP-Spiegels hemmen. Zusammen mit der Inhibition der
Zellmigration durch VILIP-1-cAMP bestätigt dies die Wirkung von VILIP-1 als
Suppressor der Tumorprogression und deutet auf eine protektive Funktion
während des EMT-Prozesses hin.
de
dc.description.abstract
Visinin-like-Protein 1 (VILIP-1), a member of the neuronal Ca2+ sensor protein
family, acts as a tumor invasion suppressor in murine squamous cell carcinoma
(SCC) by inhibiting cell-matrix adhesion and cell migration. Furthermore, in
esophageal squamous cell carcinoma and non-small cell lung carcinoma the loss
of VILIP-1 expression was correlated with clinical-pathological features and
survival. Anti-invasive effects of VILIP-1 were accompanied by lowered RhoA
and MMP 9 activity, as well as by reduced expression of fibronectin receptors
and were mediated by increased cAMP levels in VILIP-1 positive SCCs. However,
in neurons VILIP-1 was shown to modulate intracellular cGMP levels. Therefore
in this thesis a cell culture model of two aggressive SCC cell lines without
VILIP-1 expression and two less aggressive, VILIP-1 expressing cell lines was
used to analyze, whether the tumor invasion suppressing effect of VILIP-1 was
exclusively mediated by cAMP dependent pathways or may also be linked to cGMP
dependent signaling. Cyclic nucleotide measurements showed increased levels of
cGMP following stimulation of particulate guanylyl cyclases NPR-A and NPR-B in
aggressive, VILIP-1 negative SCCs. Elevated cGMP levels were found to be based
on a VILIP-1 independent upregulation of NPR-A and NPR-B and led to enhanced
cell migration and aggressiveness of SCC cells. In contrast enhanced cAMP
signaling reduced cell-matrix adhesion and cell migration. Increased basal
cAMP levels were directly correlated with VILIP-1 expression. This effect is
most likely based on enhanced surface expression of adenylyl cyclases and
would therewith be equivalent to the effect of VILIP-1 on surface expression
of NPR-B and nAChR in neurons. In addition it was an aim of this thesis to
determine extracellular signals and intracellular signaling molecules involved
in the regulation of VILIP-1 expression in tumor progression. Chronic EGF
stimulation induced EMT in VILIP-1 positive SCCs and led to the downregulation
of E-cadherin expression, as well as of VILIP-1 expression. In contrast to the
expression of integrin 5, the expression of E-cadherin was not influenced by
VILIP-1. On the other hand the expression of the transcriptional repressor
snail-1, which was expressed in VILIP-1 negative SCCs and was inducible by EGF
stimulation in VILIP-1 positive SCCs, was inhibited by both VILIP-1 expression
and elevated cAMP levels. These findings together with the determined
inhibition of cell migration by VILIP-1-cAMP points out the role of VILIP-1 as
suppressor of tumor progression and suggest a protective function of VILIP-1
in EMT.
en
dc.format.extent
XV, 103 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Visinin like Protein 1 (VILIP-1)
dc.subject
tumour invasion suppressor
dc.subject
squamous cell carcinoma
dc.subject
cell migration
dc.subject
cAMP signalling
dc.subject
cGMP signalling
dc.subject
MAPK signalling
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Regulation der Expression des Tumorinvasionssuppressors Visinin-like Protein 1
(VILIP-1) und seine Bedeutung für das Metastasierungspotential von
Plattenepithelkarzinomzellen
dc.contributor.firstReferee
Professor Karl-Heinz Braunewell
dc.contributor.furtherReferee
Professor Volker Haucke
dc.date.accepted
2009-12-01
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000015225-6
dc.title.translated
Expression of tumour invasion suppressor gene Visinin-like Protein 1 (VILIP-1)
and its role in metastasis of squamous cell carcinoma
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000015225
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000006871
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free
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open access