Die Rolle des Endozytoserezeptors Megalin (GP330) bei der Pathogenese progredienter Nephropathien

Abstract

Progrediente Nephropathien zeichnen sich durch einen langsam fortschreitenden Funktionsverlust aus, der vor allem mit Proteinurie, arteriellem Hypertonus und tubulointerstitieller Entzündung verbunden ist. Zu den häufigsten Ursachen terminaler Niereninsuffizienz zählt die Hypertonie. Unabhängig jedoch von der Art der glomerulären Primärschädigung entwickelt sich eine tubulointerstitielle Entzündung mit nachfolgender Fibrose dort, wo proximales Tubulusepithel mit Proteinen aus dem glomerulären Filtrat überladen wird. Unklar ist noch, welcher Mechanismus die Proteinrückresorption reguliert. Ziel der vorliegenden Studie war es, erstmalig die vom Endozytoserezeptor Megalin vermittelte Rückresorption als möglichen zentralen regulatorischen Mechanismus bei der Entstehung progredienter Nephropathien zu untersuchen, wofür ein nierenspezifischer Megalin-Knockout-Mausstamm zur Verfügung stand. Megalin- defizienten (cre+) und nicht defizienten (cre-), uninephrektomierten Tieren wurde zweimal im Abstand von 3 Wochen ein 21-day-DOCA-release-pellet implantiert. Die Tiere erhielten parallel über den gesamten Zeitraum 1%ige Kochsalzlösung als Trinkwasser. Als Kontrollen wurden ebenfalls Megalin- defiziente und nicht defiziente Tiere mitgeführt. Über die gesamte Versuchsdauer wurde per Telemetrie der Blutdruck der Tiere ermittelt. Wöchentlich wurden Nierenfunktionsparameter aus dem Urin sowie am Versuchsende aus dem Serum bestimmt. Außerdem wurden eine patho- und immunhistologische Analyse des Nierengewebes sowie eine Genexpressionsanalyse hinsichtlich inflammatorischer und fibrotischer Marker durchgeführt. Schwerpunkt der Untersuchungen mittels des etablierten DOCA-Modells war der Vergleich Megalin- defizienter und nicht Megalin-defizienter Tiere. 1\. Durch DOCA-Implantation konnte die erwartete, dauerhaft signifikante Erhöhung des Blutdrucks induziert werden. Diese erwies sich als Megalin-unabhängig. 2\. DOCA-Behandlung induzierte, wie erwartet, bei allen Tieren eine Verschlechterung der Nierenfunktion, welche jedoch nur bei cre-negativen Tieren signifikant abnahm. Außerdem führte DOCA zu den erwarteten Serumelekrolytverschiebungen. Der Albumin-Spiegel im Serum war bei allen Tieren der DOCA-Gruppe unabhängig vom Megalin-Phänotyp signifikant erniedrigt. Parallel dazu entwickelten DOCA- behandelte Tiere eine signifikante Zunahme der Natrium-, Kalium- und Albumin- Exkretion bei signifikant gesteigerter Diurese. Megalin-defiziente Phänotypen zeigten bezüglich aller untersuchten Urin-Parameter tendenziell höhere Exkretionswerte als nicht defiziente. 3\. DOCA-Behandlung induzierte die für dieses Modell charakteristische inflammatorische Antwort, die immunhistologisch durch signifikant erhöhte Infiltration des Nierengewebes mit Makrophagen und T-Lymphozyten sowie durch eine ausgeprägtere Expression des proinflammatorischen Zytokins MCP-1 nachgewiesen wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte im DOCA-Modell erstmals gezeigt werden, dass Megalin-Defizienz in einer signifikant geringer ausgeprägten Entzündungsreaktion resultiert. 4\. Analog zu den immunhistologischen Ergebnissen konnte per Genexpressionanalyse der DOCA-behandelten Tiere im Nierengewebe Megalin-defizienter Tiere eine geringere Aktivierung von MCP-1 und der profibrotischen Marker TGF-ß und Kollagen III als bei nicht defizienten Tieren nachgewiesen werden. Die aufgeführten, erstmalig ermittelten Ergebnisse zeigen, dass die Megalin- vermittelte Proteinendozytose ein wichtiger Mechanismus bei der Entstehung der tubulären Proteinüberladung, der inflammatorischen Antwort und nachfolgender Fibrose ist. Die bisherige Therapie chronischer Nierenerkrankungen stellt die medikamentöse Senkung des Blutdruckes in den Mittelpunkt. Die durch Einschränkung der Proteinrückresorption nachgewiesene protektive Wirkung einer verminderten Expression von Megalin auf die Progression chronischer Nephropathien könnte, eine Eliminierung der mit einer systemischen Blockade des Rezeptors einhergehenden unerwünschten Wirkungen vorausgesetzt, völlig neue therapeutische Optionen eröffnen.

Background: In progressive nephropathies, overload of tubular cells with filtered proteins translates glomerular permeability dysfunction into cellular signals of interstitial inflammation. Megalin-mediated endocytosis of proteins and further processing by the endocytosis apparatus could be basic precondition for the following inflammation signals leading to fibrosis. Blockade of the protein-endocytosis so could preserve the physiological function and counteract the loss of renal function. However, it is not known whether Megalin-blockade is protective in progressive renal injury associated with severe proteinuria. This study therefore examines the role of the endocytosis-receptor Megalin in progressive nephropathies by confronting murine Megalin-deficient phenotypes with a model of DOCA-salt-induced hypertensive nephropathy with progressive interstitial inflammation and fibrosis. Methods: DOCA-salt hypertensive nephropathy with persistent proteinuria was induced in Megalin-deficient mice by a two times subcutaneous implantation of a 50 mg 21-day DOCA-release-pellet in intervals of 3 weeks and 1 % saline given as drinking water. Bloodpressure was telemetrically controlled all along. Renal damage was evaluated following measure¬ments of functional parametres and renal histology, which was studied by morphometry and immunohistochemistry. The expression of proinflammatory, inflammatory and proliferation markers was quantified by immunohistochemistry and Realtime Online PCR. Results: DOCA-induced rise of bloodpressure, the extent of proteinuria and glomerular sclerosis was not different in Megalin-deficient animals and controls. In contrast, the associated tubulointerstitial injury consisting of tubular dilatation and atrophy, interstitial infiltration and fibrosis, was significantly lower in Megalin-deficient phenotypes. Compared to controls, Megalin-deficient mice showed a significantly reduced amount of F4/80-positive macro¬phages, T-lymphocytes and monocyte chemoattractant protein (MCP-1) in interstitial lesions. Proliferation-marker Ki-67 was also significantly reduced in Megalin-deficient mice. The mRNA expression of MCP-1, TGF-ß and Collagen III was upregulated in diseased kidneys, but also in Megalin-deficient mice not as prominent as in diseased controls. Conclusion: Megalin-deficiency substantially reduced the expression of proinflammatory, inflammatory and profibrotic markers and the subsequent renal fibrosis in DOCA murine model of hypertensive nephropathy. These findings support an important role for Megalin in proteinuric overload of proximal tubular cells and suggest that Megalin-blockade might be a new therapeutic strategy in progressive nephropathies.