Die Auswirkungen von zwei Einzelnukleotid-Polymorphismen im Lipopolysaccharid- bindenden Protein auf die Immunantwort

Abstract

LBP spielt erwiesenermaßen eine Rolle in der primären Immunantwort sowohl gegenüber Gram-negativen als auch Gram-positiven Bakterien. In Konzentrationen, die unter physiologischen Bedingungen im Serum vorkommen, ermöglicht LBP das Erkennen geringer Mengen von LPS und anderer Liganden, was zu einer inflammatorischen Immunreaktion führt. Hohe Konzentrationen, wie sie in der Akut-Phase-Reaktion gefunden werden, hemmen allerdings die Zytokinausschüttung. Polymorphismen sind mittlerweile als prädisponierende Faktoren für veränderte Krankheitsanfälligkeit oder individuell verschiedene Krankheitsverläufe anerkannt. Für das LBP sind verschiedene Polymorphismen beschrieben, von denen zwei für diese Arbeit funktionell und anhand klinischer Daten im Hinblick auf ihre Auswirkung untersucht werden. Dabei handelt es sich um die Einzelnukleotidpolymorphismen c998t (rs2232613) und t1341c (rs2232618) mit einer Allelfrequenz von 0,076 (c998t) bzw. 0,095 (t1341c) in einer repräsentativen Kontrollpopulation. Vorarbeiten zeigen für den SNP c998t einen Funktionsverlust, der sich sowohl auf die Bindungsfähigkeit gegenüber bakteriellen Liganden als auch auf die Auslösung einer gegen diese gerichteten Zytokinantwort auswirkt. Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen des Polymorphismus t1341c zu untersuchen und die Erkenntnisse zum Polymorphismus c998t weiter auszubauen. Zu diesem Zweck wurden Bindungsassays und Stimulationsversuche mit der murinen Makrophagen-Zelllinie RAW 246.7 durchgeführt, wobei sowohl Seren von Polymorphismusträgern und Wildtyp- Kontrollen als auch rekombinant hergestelltes LBP in Wildtyp- und mutierter Form verwendet wurden. Die für Bindungsassays wie auch für die Zellstimulation verwendeten Substanzen umfassen LPS 0111:B4, LPS Re 595, Lipopeptid 2 und 3 und Phosphatidylethanolamin. Die Analyse eines Patientenkollektivs an Meningitis erkrankter Kinder diente einer ersten praliminären Einschätzung einer möglichen klinischen Bedeutung der Polymorphismen. In den Bindungsassays zeigte sich ein deutlicher Funktionsverlust beider Polymorphismen gegenüber allen bakteriellen Liganden. Der Funktionsverlust ist in der Regel bei Vorliegen des Polymorphismus c998t stärker ausgeprägt, aber auch für den Polymorphismus t1341c statistisch signifikant. Erstmals wurde hier auch die Bindung des LBP an Phosphatidylethanolamin nachgewiesen, welche ebenfalls bei Vorliegen beider Polymorphismen eingeschränkt ist. Die Stimulation der Mausmakrophagen zeigte bei Stimulation mit LPS leichte Unterschiede in der TNF-α- und IL-6-Reaktion, die aber meist nicht statistisch signifikant waren. Lediglich 4 Stunden nach Stimulation mit LPS 0111:B4 ist die TNF-α-Produktion bei Vorliegen der Polymorphismen statistisch signifikant eingeschränkt. In der Analyse der Patientendaten zeigen sich Hinweise auf geschlechtsabhängige Unterschiede in der Polymorphismusverteilung, denen durch Analyse größerer Kollektive weiter nachgegangen werden muss.

LPS-Binding Protein (LBP) plays a central role in the recognition of both Gram-negative and Gram-positive bacteria. Constitutive serum concentrations enable the host to detect small concentrations of LPS and other bacterial ligands leading to an inflammatory response, whereas high concentrations as found during the acute-phase reaction inhibit cytokine release. Different polymorphisms have already been shown to change susceptibility towards and the course of diseases. For LBP, several polymorphisms have been described. Two recently discovered single-nucleotide polymorphisms (SNP) within the LBP gene (t1341c, rs2232618 and c998t, rs 2232613) were examined for this work regarding both experimental functioning and clinical data. They have an allelic frequency of 0.095 (t1341c) and 0.076 (c998t) in a representative control population. Previous work shows a loss of function for the SNP c998t regarding binding activity and initiation of an inflammatory response. Therefore, the aim was to examine wether the protein’s function is altered by the mutation t1341c as well and to gain further insight into the polymorphism c998t. To his end, binding assays were performed and the murine macrophage cell line RAW 246.7 was stimulated with bacterial ligands under the presence of sera from individuals with different genotypes regarding the two polymorphims. Additionally, experiments were conducted using recombinant LBP in wild-type or mutated form. Substances used for binding assays and stimulations comprised LPS 0111:B4, LPS Re 595, lipopeptide 2 and 3 and phosphatidylethanolamine. As to the clinical relevance of these polymorphisms, a collective of children suffering from meningitis was analyzed. Binding assays showed a clear loss of function towards all bacterial ligands for both polymorphisms. Although more distinctive for the c998t polymorphim this effect is also statistically significant for the t1341c polymorphism. Here binding of LBP towards phosphatidylalanin was shown for the first time, which is also decreased when polymorphisms are present. Stimulation of murine macrophages showed slight differences concerning the TNF-α and IL-6 response, however, most of these are not statistically significant. Only 4 hours after stimulation with LPS 0111:B4, the effect on TNF-α release is statistically significant. The analysis of patient data showed hints on gender-dependent differences regarding the distribution of polymorphisms which have to be further examined by analyzing collectives with higher numbers of patients.